PCV2b病毒样颗粒疫苗的制备及检测

发布时间：2017-05-25 08:00

  本文关键词：PCV2b病毒样颗粒疫苗的制备及检测，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：为了研制病毒样颗粒（VLP）疫苗，我们以猪圆环病毒衣壳蛋白（PCV2b-CP）为模型搭建VLP疫苗制备和检测的技术平台。采用PCR搭接方法获得密码子优化的PCV2b-CP编码基因，并以PET28a为表达载体尝试在大肠杆菌内可溶性表达PCV2b-CP。采用多种方法对PCV2b-CP的纯化及组装进行摸索同时使用透射电子显微镜（TEM）和荧光光谱分析（FSA）两种方法对VLPs的组装状态进行检测，，并对形成的VLPs的抗原性及免疫学活性进行了研究。结果显示：经大肠杆菌表达的可溶性PCV2b-CP可形成与天然病毒相似的VLPs且组装液成分影响VLPs的组装状态；PCV2b VLP能够有效诱导小鼠产生PCV2b特异性抗体，具有开发成PCV2b疫苗的潜能；FSA检测不同组装状态的VLPs发现：组装的PCV2b VLPs的发射光谱显示为在320nm处有最高值的非典型曲线，虽FSA不能取代TEM，但其可作为初步检测是否形成VLP的一种简便而快速的技术手段。
【关键词】：病毒样颗粒 PCV2b 衣壳蛋白 疫苗 荧光质谱分析 检测
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 提要4-5
• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 中英文缩写词表12-13
• 第1章 绪论13-31
• 1.1 病毒样颗粒疫苗及其研究进展13-22
• 1.1.1 病毒样颗粒及其分类13-14
• 1.1.2 病毒样颗粒的免疫原性14-15
• 1.1.3 病毒样颗粒抗原的表达15-18
• 1.1.4 病毒样颗粒的纯化和组装18-19
• 1.1.5 病毒样颗粒的鉴定19
• 1.1.6 病毒样颗粒疫苗的研究进展19-22
• 1.2 猪圆环病毒及其疫苗的研究进展22-29
• 1.2.1 猪圆环病毒的特性22-25
• 1.2.2 猪圆环病毒相关疾病25-26
• 1.2.3 猪圆环病毒疫苗研究进展26-29
• 1.3 本研究的目的和意义29-31
• 第2章 材料与方法31-45
• 2.1 实验材料31-33
• 2.1.1 试剂和材料31-32
• 2.1.2 质粒和菌种32
• 2.1.3 培养基32
• 2.1.4 实验动物32
• 2.1.5 主要实验设备32-33
• 2.2 引物设计与合成33-34
• 2.3 实验方法34-45
• 2.3.1 PCV2b-CP 编码基因的合成及重组质粒的构建34-37
• 2.3.2 重组质粒 pET28a-CP-His 的构建37
• 2.3.3 CP-His 在大肠杆菌中的表达与鉴定37-39
• 2.3.4 重组蛋白 CP-His 的纯化方法摸索39-41
• 2.3.5 纯化后蛋白 CP-His 的鉴定检测41-42
• 2.3.6 病毒样颗粒的组装及鉴定42-43
• 2.3.7 PCV2b 病毒样颗粒的活性检测43-45
• 第3章 实验结果45-67
• 3.1 PCV2b CP 编码基因的获取45-49
• 3.1.1 PCV2b CP 编码基因的书写45
• 3.1.2 PCR 搭建方法获取 A、B 基因片段45-46
• 3.1.3 A、B 基因片段的 T-A 克隆46-47
• 3.1.4 重组质粒 pET28a-CP 的构建47-49
• 3.2 PCV2b CP-His 编码基因的获取及基因克隆49-51
• 3.2.1 PCV2b CP-His 编码基因的获取49-50
• 3.2.2 PCV2b CP-His 编码基因的 T-A 克隆50
• 3.2.3 pET28a-CP-His 重组质粒的构建50-51
• 3.3 重组蛋白 CP-His 在大肠杆菌内表达及鉴定51-52
• 3.4 CP-His 蛋白纯化条件的摸索52-58
• 3.4.1 分子筛层析法纯化53-54
• 3.4.2 硫酸铵沉淀法纯化54-55
• 3.4.3 镍亲和层析法纯化55-58
• 3.5 Western blot 检测纯化后 CP-His58-59
• 3.6 不同条件下 VLP 的组装及检测59-63
• 3.6.1 CP-His 的组装和透射电镜方法检测 VLP59-61
• 3.6.2 荧光质谱分析法检测 VLPs61-63
• 3.7 PCV2b VLPs 疫苗的活性检测63-67
• 3.7.1 PCV2b VLPs 的抗原性检测64
• 3.7.2 PCV2b VLPs 诱导小鼠产生 PCV2b 特异性抗体的效力64-67
• 第4章 讨论67-73
• 4.1 CP-His 编码基因的输写67-68
• 4.2 CP-His 纯化的影响因素68-70
• 4.3 CP-His 组装的影响因素70-71
• 4.4 FSA 检测 VLP 组装与去组装的可行性71-72
• 4.5 VLPs 的活性检测72-73
• 第5章 结论73-75
• 参考文献75-89
• 作者简介及科研成果89-91
• 致谢91-92

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 李少伟,张军,何志强,葛胜祥,顾颖,林鉴,刘如石,夏宁邵;大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒ORF2片段的聚合现象研究[J];生物工程学报;2002年04期

2 贾峗,芦银华,张素芳,周斌,陈溥言;猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪细小病毒混合感染的流行病学调查[J];中国病毒学;2004年05期

3 赵玮,廖国阳,蒋燕军,姜述德;Expression and self-assembly of HCV structural proteins into virus-like particles and their immunogenicity[J];Chinese Medical Journal;2004年08期

4 王忠田,杨汉春,郭鑫;规模化猪场猪圆环病毒2型感染的流行病学调查[J];中国兽医杂志;2002年10期

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本文编号：393087