白色念珠菌H3K4甲基转移酶N端肽段的原核表达及应用

发布时间：2017-05-25 14:08

  本文关键词：白色念珠菌H3K4甲基转移酶N端肽段的原核表达及应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：近年来,随着大量免疫抑制剂、化疗药物和广谱抗生素的广泛应用,侵袭性念珠菌感染(invasive candidiasis, IC)的发病率和死亡率不断上升。但因缺乏特异的临床症状,且血培养和组织病理学检查这两种确诊方法缺乏敏感性,往往延误治疗,因此亟需更快速、敏感的方法用于IC的诊断。国内外学者已经把注意力集中于用血清学方法检测患者血液中的白念珠茵特异性抗原、抗体及代谢产物上。研究表明白色念珠菌H3K4甲基转移酶是IC血清学诊断中的一个候选抗原。 目的 原核表达白色念珠茵H3K4甲基转移酶N末端肽段(N-terminal region of histone3lysine4methyltransferase, Setl-208p),建立检测人血清中抗Setl-208p IgG类抗体的ELISA方法,评估其在IC中的早期诊断价值。 方法 对GenBank报道的白色念珠菌H3K4甲基转移酶(histone3lysine4methyltransferase, Setlp)与其他物种H3K4甲基转移酶进行序列比对,选择与人类无同源性的抗原特异性片段,设计一对引物,以白色念珠茵C1标准株基因组DNA为模板,PCR扩增Setl-208p的编码基因,以pET28a(+)为载体,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌,并用IPTG诱导重组蛋白质表达,Talon金属亲和柱层析纯化后用抗his标签的单克隆抗体进行鉴定。纯化的Setl-208p一方面用于免疫家兔,制备多克隆抗体。另一方面用于建立检测人血清中相应IgG类抗体的ELISA方法,并评估其在家兔感染模型以及IC患者中早期诊断价值。 结果 成功克隆了白色念珠菌抗原特异性H3K4甲基转移酶片段Setl-208p基因,制备了相应的工程菌株,诱导表达并获得了纯化的重组肽段,所得蛋白约为29kDa,带有His标签,经western blot鉴定表明诱导的重组蛋白可与IC病人血清发生特异性反应；制备了针对白色念珠菌Setl-208p的兔抗血清,western blot结果显示特异性良好;建立了检测抗白色念珠茵抗Setl-208p抗体的ELISA方法,以该法检测兔模型血清,在感染第4天开始抗体阳性,病人血清检测结果显示,该方法对IC的诊断敏感性为79.2%,特异性为90%,且与细菌感染及其他真菌感染病人(如曲霉)无非特异交叉反应。 结论 成功表达了白色念珠菌H3K4甲基转移酶N末端肽段Setl-208p重组蛋白质,建立了检测抗Setl-208p抗体的ELISA法,证明该方法对IC的诊断具有潜在应用价值。
【关键词】：白色念珠菌 H3K4甲基转移酶 原核表达 多克隆抗体 ELISA
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R379.4
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 英文缩略语表7-12
• 第一章 绪论12-19
• 1.1 侵袭性念珠菌感染诊断研究进展12-17
• 1.1.1 直接镜检与培养法12
• 1.1.2 组织病理学检查12-13
• 1.1.3 分子生物学方法13
• 1.1.4 血清学方法13-17
• 1.1.4.1 抗原检测13-14
• 1.1.4.2 抗体检测14-16
• 1.1.4.3 联合检测在诊断IC中的应用16-17
• 1.2 白色念珠菌H3K4甲基转移酶17-19
• 第二章 白色念珠菌H3K4甲基转移酶N端肽段重组蛋白的制备19-36
• 2.1 实验材料19-24
• 2.1.1 PCR引物设计与合成19
• 2.1.2 质粒与菌株19
• 2.1.3 二具酶及主要试剂19
• 2.1.4 血清来源19-20
• 2.1.5 主要溶液配制20-24
• 2.1.6 主要仪器24
• 2.2 实验方法24-30
• 2.2.1 白色念珠菌H3K4甲基转移酶N端肽段全长基因的获得24-25
• 2.2.2 克隆载体的构建25-28
• 2.2.3 表达载体的构建28
• 2.2.4 重组蛋白的诱导表达、纯化、鉴定及抗原性分析28-30
• 2.3 结果30-34
• 2.3.1 蛋白质氨基酸(aa)序列比对30-31
• 2.3.2 白色念珠菌Setl-208p全长基因的PCR扩增31-32
• 2.3.3 重组克隆载体、表达载体的鉴定32
• 2.3.4 重组蛋白的表达、鉴定及抗原性分析32-33
• 2.3.5 重组蛋白的纯化33-34
• 2.4 讨论34-36
• 第三章 检测白色念珠菌H3K4甲基转移酶N端肽段抗体的ELISA方法建立36-40
• 3.1 主要试剂36
• 3.1.1 血清样本36
• 3.1.2 主要试剂及仪器36
• 3.2 实验方法36-37
• 3.2.1 Setl-208p重组蛋白质的制备36-37
• 3.2.2 ELISA方法建立37
• 3.2.3 方法学考核37
• 3.3 实验结果37-38
• 3.3.1 ELISA方法的建立37
• 3.3.2 ELISA方法学考核37-38
• 3.3.3 IC兔模型不同病程血清测定结果38
• 3.4 讨论38-40
• 第四章 ELISA检测抗白色念珠菌H3K4甲基转移酶N端肽段抗体在IC患者中的应用40-49
• 4.1 实验材料40-41
• 4.1.1 标本来源40
• 4.1.2 主要试剂及仪器40-41
• 4.2 实验方法41
• 4.2.1 ELISA方法建立41
• 4.2.2 cut-off值确定41
• 4.2.3 统计学分析41
• 4.3 结果41-47
• 4.3.1 ELISA方法的建立41
• 4.3.2 cut off值确定41-42
• 4.3.3 抗Setl-208p抗体测定结果42-47
• 4.3.4 患者外周血WBC数对抗Setl-208p抗体水平的影响47
• 4.4 讨论47-49
• 第五章 白色念珠菌H3K4甲基转移酶N端肽段多克隆抗体的制备及鉴定49-52
• 5.1 实验材料49
• 5.1.1 主要实验仪器及试剂49
• 5.1.2 实验动物49
• 5.2 实验方法49-50
• 5.2.1 重组抗原的准备49
• 5.2.2 免疫方法49-50
• 5.2.3 ELISA法测定免疫兔血清效价50
• 5.2.4 双向免疫扩散50
• 5.2.5 western blot分析50
• 5.3 结果50-51
• 5.3.1 效价测定50
• 5.3.2 向免疫扩散50
• 5.3.3 western blot分析50-51
• 5.4 讨论51-52
• 第六章 主要结论及展望52-53
• 6.1 主要结论52
• 6.2 展望52-53
• 参考文献53-57
• 研究生期间论文发表及参加会议情况57-58
• 致谢58

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本文编号：393958