化脓性链球菌htrA与蛋白分泌相关性初步研究

发布时间：2017-05-26 19:11

  本文关键词：化脓性链球菌htrA与蛋白分泌相关性初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：化脓性链球菌为革兰氏阳性人类专性致病菌,可引起从轻微的皮肤化脓性感染(脓疱病)和咽炎,到危及生命的坏死性筋膜炎,链球菌侵袭性感染如中毒性休克综合征等疾病,反复的化脓性链球菌感染可引起严重的包括急性风湿热和肾小球肾炎等的免疫后遗症。其致病性是由其分泌的毒力和侵袭性酶所致,其中链球菌溶血素,致热外毒素B是引起化脓性链球菌感染性疾病的重要毒素。Caparon等认为化脓性链球菌通过一个称为"ExPortal"微结构的转运系统进行包括毒力因子在内的蛋白的分泌与运输。目前证实链球菌致热外毒素B,溶血素是通过该结构域进行分泌与成熟的,而HtrA作为蛋白质分泌分子伴侣在该结构域高浓度聚集,因此推测HtrA参与化脓性链球菌蛋白的分泌过程。 本研究用温度敏感自杀质粒/电转化方法,构建htrA基因跨膜结构域缺失突变株SPD14和htrA跨膜结构域缺失补偿株SPC15以及htrA基因壮观霉素插入突变株SPI28,以化脓性链球菌的两个重要胞外毒素——链球菌溶血素和致热外毒素B为研究对象,研究化脓性链球菌htrA基因缺失对胞外毒素活性和分泌的影响,血平板分析溶血素活性实验结果表明,htrA基因跨膜结构域缺失突变和htrA基因壮观霉素插入突变下调化脓性链球菌溶血素的活性。酪素平板分析SpeB活性结果显示,无论是htrA基因跨膜结构域缺失突变,还是htrA基因插入突变都推迟SpeB活性形成。用SDS-PAGE垂直电泳分析菌株培养上清液中胞外蛋白SpeB的含量结果发现,与野生型菌株SPXL1、htrA基因壮观霉素插入突变株SPI28和htrA跨膜结构域缺失补偿株SPC15相比较,htrA基因跨膜结构域缺失影响SpeB蛋白的分泌与成熟。用碱性磷酸酶表达载体研究htrA基因缺失对碱性磷酸酶分泌影响实验发现,携带碱性磷酸酶表达载体的htrA基因跨膜结构域缺失突变株SPZ7和htrA基因壮观霉素插入突变株SPZ36的胞外碱性磷酸酶(PhoZ)活性分别是野生型菌株SPZ35的85%和106%,这表明htrA基因跨膜结构域可能会影响碱性磷酸酶分泌。化脓性链球菌动物细胞的粘附实验结果发现,SPD14对细胞的粘附只有野生型的9.6%,而SPI28对细胞的粘附性与野生型相差不大,考虑到htrA基因跨膜结构域缺失会影响蛋白的分泌,htrA基因跨膜结构域缺失对细胞的粘附影响可能与htrA基因跨膜结构域缺失株表面与宿主细胞粘附有关因子的减少有关。 本实验研究结果表明,htrA基因影响化脓性链球菌的溶血素和致热外毒素B的活性,htrA基因跨膜结构域影响SpeB的分泌,胞外碱性磷酸酶活性以及对宿主细胞的粘附,我们推测化脓性链球菌htrA基因跨膜结构域参与蛋白的分泌,htrA基因跨膜结构域可能足化脓性链球菌蛋白分泌‘ExPortaⅠ”结构组成成分,研究结果对化脓性链球菌毒力因子的转运及致病机理研究将起到积极的作用,或许在基于蛋白分泌与转运方面,找到药物筛选的新靶点。
【关键词】：化脓性链球菌 htrA基因 跨膜结构域缺失突变株 溶血素 致热外毒素B
【学位授予单位】：西南交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.12
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 绪论13-23
• 1.1 概述13
• 1.2 化脓性链球菌感染的诊断13-15
• 1.3 化脓性链球菌的致病机理15-16
• 1.3.1 粘附素15
• 1.3.2 链球菌溶血素O(SLO)15
• 1.3.3 链球菌溶血素S(SLS)15-16
• 1.3.4 致热性外毒素(SPE)16
• 1.3.5 M蛋白16
• 1.4 化脓性链球菌与致热性外毒素SpeB16-18
• 1.4.1 SpeB的结构与表达调控16-17
• 1.4.2 SpeB与细胞凋亡17
• 1.4.3 SpeB与化脓性链球菌感染17-18
• 1.5 HtrA丝氨酸蛋白酶基因对化脓性链球菌SpeB的影响18-20
• 1.6 课题的研究内容与意义20-22
• 1.7 实验技术路线22-23
• 第二章 htrA基因突变株的构建23-48
• 2.1 实验材料23-25
• 2.1.1 菌种与质粒23
• 2.1.2 实验试剂与仪器23-24
• 2.1.3 培养基与溶剂24-25
• 2.2 实验方法25-38
• 2.2.1 化脓性链球菌SPXL1基因组DNA的提取25-26
• 2.2.2 DH5α感受态细胞的制作26
• 2.2.3 温度敏感型质粒pJRS700质粒的提取26-27
• 2.2.4 SPXL1感受态细胞的制备27-28
• 2.2.5 htrA基因跨膜结构域缺失突变株的构建28-34
• 2.2.6 htrA基因跨膜结构域缺失突变株的确认34-36
• 2.2.7 htrA基因跨膜结构域缺失补偿株的构建36
• 2.2.8 跨膜结构域缺失补偿株构建的确认36
• 2.2.9 htrA基因插入突变株的构建36-38
• 2.3 实验结果与讨论38-46
• 2.3.1 PCR扩增htrA基因38-39
• 2.3.2 ClaⅠ酶切PCR产物和质粒载体pJRS70039-40
• 2.3.3 htrA基因载体pXL22(pJRS700-htrA)的构建40-41
• 2.3.4 htrA基因缺失质粒pXL44的构建41
• 2.3.5 htrA基因跨膜结构域缺失突变株的筛选与确认41-43
• 2.3.6 htrA基因跨膜结构域缺失补偿株的构建43-44
• 2.3.7 PCR扩增spec表达盒44
• 2.3.8 SpeⅠ酶切PCR产物和pXL22质粒44-45
• 2.3.9 pXL43质粒的构建45
• 2.3.10 htrA基因插入突变株的构建45-46
• 2.4 本章小结46-48
• 第三章 htrA基因跨膜结构域缺失对GAS毒素的影响48-53
• 3.1 实验材料48-49
• 3.1.1 实验菌种48
• 3.1.2 实验仪器与试剂48
• 3.1.3 培养基与溶剂48-49
• 3.2 实验方法49
• 3.2.1 htrA基因对GAS溶血素活性的影响49
• 3.2.2 htrA基因对致热外毒素B活性的影响49
• 3.3 实验结果49-51
• 3.3.1 溶血素活性实验结果49-50
• 3.3.2 htrA基因对致热外毒素B活性的影响结果50-51
• 3.4 本章小结51-53
• 第四章 htrA对GAS蛋白分泌的影响53-67
• 4.1 实验材料53-55
• 4.1.1 实验菌种53
• 4.1.2 实验试剂与仪器53-54
• 4.1.3 培养基与溶剂54-55
• 4.2 实验方法55-60
• 4.2.1 htrA基因对SpeB蛋白酶分泌的影响55-57
• 4.2.2 htrA基因对碱性磷酸酶分泌的影响57-59
• 4.2.3 细胞粘附性实验59-60
• 4.3 实验结果60-65
• 4.3.1 htrA基因对蛋白分泌影响实验结果60-63
• 4.3.2 htrA基因对外源蛋白碱性磷酸酶分泌的影响63-64
• 4.3.3 细胞粘附性实验64-65
• 4.4 本章小结65-67
• 结论67-69
• 致谢69-70
• 参考文献70-75
• 攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果75

【参考文献】

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1 李彩虹;化脓性链球菌表面蛋白Fba的免疫原性研究[D];河北医科大学;2007年

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