重组质粒EGFP-N1-BDNF的构建及转染

发布时间：2017-05-26 19:18

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【摘要】：目的：体外构建脑源性神经营养因子(BDNF)的重组质粒EGFP-N1-BDNF载体；利用脂质体转染方式将质粒导入Hela及骨髓间充质干细胞中；尝试利用纳米转染方式将质粒导入Hela及骨髓间充质干细胞中。 方法：在人睾丸组织中提取RNA,并逆转录成cDNA。然后进行高保真PCR扩增得到脑源性神经营养因子,将其克隆入T载体和真核表达载体EGFP-N1中,通过菌落PCR、双酶切及测序进行鉴定后,采用脂质体和纳米两种方法分别转入Hela和骨髓间充质干细胞中,用荧光显微镜和Western blot鉴定转染情况。 结果：重组质粒EGFP-N1-BDNF经酶切和序列分析鉴定与预期设计一致；利用脂质体转染方式将质粒成功导入Hela及骨髓间充质干细胞中,并在Hela及骨髓间充质干细胞中有效表达；尝试利用纳米转染方式将质粒导入Hela及骨髓间充质干细胞中,并且转染成功,并在Hela及骨髓间充质干细胞中有效表达。 结论：成功构建重组质粒EGFP-N1-BDNF载体；荧光显微镜下鉴定及Western blot检测证实脂质体及纳米转染质粒EGFP-N1-BDNF成功。图15幅,表7个,参考文献13篇。
【关键词】：脑源性神经营养因子 基因克隆 转染 脊髓损伤
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-7
• 目录7-9
• 符号说明9-10
• 第一章 前言10-12
• 第二章 材料与方法12-27
• 2.1 材料和仪器12-15
• 2.1.1 试剂12
• 2.1.2 主要仪器12-13
• 2.1.3 Western blot分析试剂13-15
• 2.2 方法15-27
• 2.2.1 重组质粒载体EGFP-N1-BDNF的构建15-22
• 2.2.1.1 目的基因的扩增15-16
• 2.2.1.2 载体pUCm-T-BDNF的构建及鉴定16-18
• 2.2.1.3 重组表达质粒EGFP-N1-BDNF的构建和鉴定18-22
• 2.2.2 转染22-24
• 2.2.2.1 细胞换液、培养、种板及传代22-23
• 2.2.2.2 脂质体及PI修饰纳米介导两种质粒载体转染Hela细胞23
• 2.2.2.3 脂质体及PI修饰纳米介导两种质粒载体转染BMSC细胞23-24
• 2.2.3 Western blot检测BDNF基因的表达情况24-27
• 2.2.3.1 总蛋白的提取24
• 2.2.3.2 SDS-PAGE电泳24-26
• 2.2.3.3 免疫反应26
• 2.2.3.4 化学发光、显影、定影26-27
• 第三章 结果27-37
• 3.1 EGFP-N1-BDNF真核质粒载体测序结果及酶切鉴定27-29
• 3.2 脂质体及纳米介导质粒载体转染Hela细胞后的免疫荧光鉴定29-31
• 3.2.1 脂质体介导质粒载体转染Hela细胞后的免疫荧光鉴定29-30
• 3.2.2 纳米介导质粒载体转染Hela细胞后的免疫荧光鉴定30-31
• 3.3 脂质体及纳米介导质粒载体转染BMSC细胞后的免疫荧光鉴定31-33
• 3.3.1 脂质体介导质粒载体转染BMSC细胞后的免疫荧光鉴定31-32
• 3.3.2 纳米介导质粒载体转染BMSC细胞后的免疫荧光鉴定32-33
• 3.4 Western blot检测BDNF蛋白的表达33-34
• 附图34-37
• 第四章 讨论37-38
• 第五章 结论38-39
• 第六章 本研究的意义及待解决的问题39-40
• 参考文献40-41
• 综述41-52
• 参考文献48-52
• 攻读硕士学位期间主要研究成果52-53
• 致谢53-54

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 李康杰;姜永杰;元虎;;脊髓损伤的治疗进展[J];中国医药导刊;2009年01期

2 孙勇,侍坚,陆佩华;神经营养因子与神经干细胞[J];生理科学进展;2002年04期

3 蔡培强,汤逊,林月秋;脊髓损伤的基因治疗实验研究(综述)[J];伤残医学杂志;2005年01期

4 刘丽霞;王永成;;神经干细胞转基因疗法与运动性脊髓损伤的治疗[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年27期

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本文编号：397854