铜绿假单胞菌铁载体pyoverdine在周质空间合成途径中蛋白质结构与功能的研究

发布时间：2017-05-26 20:00

  本文关键词：铜绿假单胞菌铁载体pyoverdine在周质空间合成途径中蛋白质结构与功能的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：铜绿假单胞菌是一种条件致病菌,能够在医院中引起10%-20%的感染,一旦感染,普通的抗生素很难根除,而且死亡率很高,因此,预防铜绿假单胞菌感染,是非常重要的。铜绿假单胞菌一个重要的致病因素就是一种能够螯合铁的小分子物质-铁载体。 一直以来,铁载体作为微生物获得铁的主要方式,它的合成和转运机制研究具有重要理论意义与实际应用价值。在铜绿假单胞菌中有两种比较重要的铁载体,一种为pyochelin螯铁蛋白,另一种为pyoverdine(PVD)水溶性荧光素铁载体。由于所有类型的PVD都具有同样的高度保守的荧光基团,上述蛋白在各种荧光假单胞菌中也是高度保守的,因此我们期望通过X射线晶体学的方法来解析合成PVD的一系列酶分子结构,为抗铜绿假单胞菌的高效、专一性药物的设计提供新的靶点。 铜绿假单胞菌PAO1的PVDI是pyoverdine研究的原型,己发现十几种基因参与其合成。在本论文是以与PVDI成熟过程中相关的蛋白质为研究对象的。PVD的成熟过程如下：在细胞质中,在NRPS催化下ferribactin前体合成,ferribactin同时携带不成熟的发色团(chromophore),在PvdE作用下转运到周质空间,在PvdN、O、P、Q以及其它未知蛋白作用下,完成PVDI的合成,此时PVDI具有荧光基团,即合成了成熟的chromophore,在未知转运蛋白作用下转运到细胞外。 为了阐明PvdN、PvdO以及PvdP在PVD成熟途径中的作用,本文使用分子生物学的方法克隆表达和纯化了PvdO以及PvdN的native蛋白质和硒代蛋白质,并进行了晶体生长和优化,得到良好的单晶,在SSRF收集并处理了数据,用CCP4, COOT, Phenix及CNS等结构生物学软件解析了PvdO以及PvdN的结构。通过分子生物学的方法也克隆表达和纯化了PvdP的蛋白质,并进行了晶体的生长和优化,也得到了晶型比较好的单晶,但是不能够拿到晶体的数据。通过对PvdO以及PvdN的结构分析,设计了相对应的功能实验,期望能够获得PvdO以及PvdN的催化机制。
【关键词】：铜绿假单胞菌 铁载体PVD 结构 催化机制
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.991
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 符号说明10-11
• 第一章 前言11-23
• 1.1 铁载体11-12
• 1.1.1 铁载体定义11-12
• 1.1.2 铁载体合成途径12
• 1.1.3 铁载体重要功能12
• 1.2 铜绿假单胞菌12-17
• 1.2.1 铜绿假单胞菌生物学特性12-13
• 1.2.2 铜绿假单胞菌的铁载体13-14
• 1.2.3 铜绿假单胞菌对人类的威胁14
• 1.2.4 PvdI的合成途径14-17
• 1.3 本文的主要内容、目的、意义及创新点17-23
• 1.3.1 蛋白质生物学分析17-20
• 1.3.2 研究内容20
• 1.3.3 目的、意义20-21
• 1.3.4 创新21-23
• 第二章 蛋白的表达、纯化与结晶23-59
• 2.1 实验材料23-28
• 2.1.1 菌株和质粒23
• 2.1.2 试剂和工具酶23-24
• 2.1.3 常规仪器24
• 2.1.4 试剂24-28
• 2.2 实验方法28-38
• 2.2.1 PvdO表达载体的构建28-33
• 2.2.2 PvdN表达载体的构建33-34
• 2.2.3 PvdP表达载体的构建34-35
• 2.2.4 蛋白的表达与纯化35-38
• 2.3 实验结果38-50
• 2.3.1 PvdO的分离纯化38-43
• 2.3.2 PvdP的分离纯化43-46
• 2.3.3 PvdN的分离纯化46-50
• 2.4 蛋白质晶体的筛选、优化50-56
• 2.4.1 引言50
• 2.4.2 实验材料50-51
• 2.4.3 蛋白质的结晶51-53
• 2.4.4 PvdO的晶体53-55
• 2.4.5 PvdP的晶体55
• 2.4.6 PvdN的晶体55-56
• 2.5 本章小结56-59
• 第三章 解析蛋白质结构59-73
• 3.1 收集与处理衍射数据59
• 3.1.1 X射线的产生59
• 3.1.2 X射线晶体结构分析的基本原理59
• 3.2 收集与处理衍射数据59-63
• 3.2.1 测试晶体衍射数据59-60
• 3.2.2 在SSRF上收集数据60
• 3.2.3 晶体的快速冷冻60
• 3.2.4 处理衍射数据60-62
• 3.2.5 数据处理的结果62-63
• 3.3 相位的确定63-67
• 3.3.1 相位问题63
• 3.3.2 相位确定的方法63-66
• 3.3.3 实验结果66-67
• 3.4 电子密度图的解析与模型构建67-68
• 3.4.1 电子密度图67-68
• 3.4.2 建立结构模型68
• 3.5 修正结构模型68-73
• 3.5.1 结构修正的原理68-69
• 3.5.2 修正结构的一般方法69-70
• 3.5.3 结构修正的结果70-73
• 第四章 PvdO与PvdN结构与功能的研究73-85
• 4.1 实验的理论技术和方法73-79
• 4.1.1 动态光散射(DLS)73-75
• 4.1.2 等温滴定量热法(ITC)75-76
• 4.1.3 差示扫描量热法(DSC)76-79
• 4.2 晶体结构与功能描述79-83
• 4.2.1 PvdO晶体结构与功能79-82
• 4.2.2 PvdN晶体结构与功能82-83
• 4.3 本章总结83-85
• 全文总结和讨论85-87
• 参考文献87-95
• 致谢95-96
• 学位论文评阅及答辩情况表96

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 梁建根;郝中娜;王连平;陶荣祥;郑经武;;嗜铁素功能研究概述[J];中国农学通报;2011年05期

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本文编号：397887