麻疹病毒血凝素蛋白H诱导HeLa细胞凋亡及其分子作用机制研究

发布时间：2024-05-24 23:12

　　麻疹病毒囊膜蛋白由血凝素蛋白(MV-H)和融合蛋白(MV-F)组成,它与易感细胞表面上的病毒受体蛋白结合介导了麻疹病毒的侵染。尽管麻疹病毒囊膜蛋白能诱使麻疹感染患者出现免疫抑制这一现象已经在科学界得到了公认,但是,麻疹病毒囊膜蛋白是否具有诱导细胞凋亡功能,目前研究结果尚不一致。在本研究中,为研究麻疹病毒囊膜蛋白能否诱导其易感细胞凋亡,我们先用MV-H和MV-F蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1-h和pHM6-f分别单独转染,或共转染HeLa细胞,然后用一系列方法检测了各实验组细胞的形态学、生物化学变化。研究发现,在单独转染了pcDNA3.1-h质粒,和共转染了pcDNA3.1-h/pHM6-f质粒的HeLa细胞中,光镜镜检可见细胞形态不规则,出现了变圆、固缩、脱壁等凋亡现象；MTT检测发现细胞存活率显著降低；Hoechst33258染色分析发现细胞出现核染色质固缩、凝聚、核碎裂等变化；DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析发现细胞DNA片段化,形成了典型的"DNA ladder";Annexin-V/PI双染分析发现细胞凋亡率明显增加。而单独转染了pHM6-f质粒的HeLa细胞,及阴性对照组细...

【文章页数】：135 页

【学位级别】：博士

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论文创新点
中文摘要
Abstract
第一章 麻疹病毒相关研究进展
    (一) 麻疹病毒的生物学特征
        1.1 前言
        1.2 麻疹病毒的分类学定位
        1.3 麻疹病毒粒子的形态
        1.4 麻疹病毒基因组
        1.5 麻疹病毒基因组编码蛋白的结构与功能
            1.5.1 核衣壳蛋白
            1.5.2 P、C、V蛋白
            1.5.3 基质蛋白
            1.5.4 融合蛋白
            1.5.5 血凝素蛋白
            1.5.6 L蛋白
        1.6 麻疹病毒的受体
            1.6.1 CD46
            1.6.2 SLAM
            1.6.3 Nectin-4
        1.7 麻疹病毒感染和复制周期
            1.7.1 病毒粒子的吸附、侵入和脱壳
            1.7.2 病毒基因的转录和翻译
            1.7.3 病毒基因组的复制
            1.7.4 病毒粒子的装配和释放
        1.8 麻疹病毒在人体内感染和释放途径
        1.9 麻疹病毒的分子流行病毒学
        1.10 麻疹病毒感染与机体的免疫反应
            1.10.1 麻疹病毒感染与免疫应答反应
            1.10.2 麻疹病毒感染后的免疫抑制反应
        1.11 麻疹病毒在肿瘤基因治疗方面的应用
            1.11.1 减毒疫苗株麻疹病毒和肿瘤基因治疗
            1.11.2 重组溶瘤麻疹病毒和肿瘤基因治疗
            1.11.3 麻疹病毒表达的相关蛋白和肿瘤基因治疗
    (二) 病毒感染和细胞凋亡
        1.12 细胞凋亡的概念
        1.13 细胞凋亡的信号转导途径
            1.13.1 死亡配体/受体信号转导途径
            1.13.2 线粒体介导的细胞凋亡信号转导途径
            1.13.3 内质网介导的细胞凋亡信号转导途径
            1.13.4 三条细胞凋亡信号转导途径间的交义对话
        1.14 病毒感染与细胞凋亡
            1.14.1 病毒感染诱发细胞凋亡
            1.14.2 病毒感染抑制细胞凋亡
        1.15 本工作的研究背景和研究目的
第二章 麻疹病毒血凝素蛋白H诱导HeLa细胞凋亡
    摘要
    2.1 前言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 细胞、质粒、抗体和试剂
        2.2.2 脂质体介导的质粒DNA对HeLa细胞的转染
        2.2.3 MTT法检测细胞存活率
        2.2.4 细胞形态镜检
        2.2.5 DNA片段化分析(“DNA ladder”检测)
        2.2.6 Hoechst 33258染色分析
        2.2.7 Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡
        2.2.8 细胞表面蛋白的流式细胞术(Flow cytometry)定量分析
        2.2.9 Western blot分析
        2.2.10 统计分析
    2.3 研究结果
        2.3.1 MV-H和MV-F蛋白在HeLa细胞中的表达
        2.3.2 MV-H蛋白降低了HeLa细胞的存活率
        2.3.3 MV-H蛋白诱导HeLa细胞凋亡的细胞形态学观察
        2.3.4 MV-H蛋白诱导HeLa细胞凋亡的细胞核形态变化
        2.3.5 MV-H蛋白诱导的HeLa细胞DNA片段化
        2.3.6 MV-H蛋白诱导HeLa细胞凋亡的Annexin-V/PI双染分析
    2.4 讨论
第三章 MV-H蛋白诱导HeLa细胞凋亡的分子机制
    摘要
    3.1 前言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 细胞、质粒、抗体和试剂
        3.2.2 细胞培养和质粒转染
        3.2.3 Annexin-V/PI双染法检测凋亡
        3.2.4 Western blot分析
        3.2.5 细胞表面蛋白的流式细胞仪定量分析
        3.2.6 线粒体跨膜电位(△Ψm)的测定
        3.2.7 线粒体组分和细胞质组分的分离
        3.2.8 Caspases活性检测
        3.2.9 细胞凋亡抑制试验
        3.2.10 统计分析
    3.3 研究结果
        3.3.1 MV-H蛋白上调了细胞TRAIL和DR5的表达
        3.3.2 TRAIL-R2：Fc抑制了MV-H蛋白诱导的细胞凋亡
        3.3.3 MV-H蛋白诱导了细胞线粒体跨膜电位(△Ψm)下降
        3.3.4 MV-H蛋白诱导了线粒体中Cyto-C和AIF的释放
        3.3.5 MV-H蛋白诱导了Bax表达上调及其转位
        3.3.6 MV-H蛋白诱导了caspases和PARP的切割
        3.3.7 Caspase-9、caspase-8和caspase-3的活性检测结果
        3.3.8 Caspase抑制剂抑制了MV-H蛋白诱导的细胞凋亡
        3.3.9 MV-H诱导的细胞凋亡通路中,存在着死亡受体途径和线粒体途径间的交叉对话
    3.4 讨论
第四章 H-CD46相互作用介导了MV-H蛋白诱导的HeLa细胞凋亡
    摘要
    4.1 前言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 细胞、质粒、抗体和试剂
        4.2.2 细胞培养和质粒转染
        4.2.3 用Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡
        4.2.4 Western blot分析
        4.2.5 用流式细胞仪定量分析细胞表面蛋白
        4.2.6 线粒体跨膜电位(△Ψm)的分析
        4.2.7 线粒体及细胞质组分的分离
        4.2.8 Caspases活性检测
        4.2.9 细胞凋亡抑制试验
        4.2.10 统计分析
    4.3 研究结果
        4.3.1 MV-H蛋白诱导了HeLa细胞的直接凋亡和“旁路凋亡”
        4.3.2 MV-H蛋白上调了H蛋白阳性细胞和H蛋白阴性细胞的TRAIL和DR 的表达
        4.3.3 anti-CD46和anti-MV-H抗体抑制了MV-H蛋白诱导的细胞凋亡
        4.3.4 anti-CD46和anti-MV-H抗体抑制了MV-H蛋白诱导的TRAIL/DR5的表达上调
        4.3.5 anti-CD46和anti-MV-H抗体抑制了MV-H蛋白诱导的△Ψm下降
        4.3.6 anti-CD46和anti-MV-H抗体抑制了MV-H诱导的caspases活化
    4.4 讨论
论文总结
参考文献
博士期间发表和待发表的文章
致谢



本文编号：3981360