磷酸化修饰对HSF4b转录活性的调控

发布时间：2017-05-27 10:04

  本文关键词：磷酸化修饰对HSF4b转录活性的调控，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景 白内障是由于眼球晶状体的部分或全部浑浊化所导致的视力下降。可分为早发型（先天性）白内障和遗传性白内障。先天性白内障是指出生后一年内出现的晶状体浑浊，是儿童视力丧失的主要原因之一。先天性白内障的遗传方式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X连锁隐性遗传等，其中以常染色体显性遗传性先天性白内障（ADCC）为主。 到目前为止，通过对一系列ADCC家族进行基因连锁分析，对先天性白内障的遗传背景有了更加详细的了解，约有40多个遗传位点和常染色体显性先天性白内障有关，按照其编码蛋白功能，与人类ADCC有关的基因分一下四类：晶状体蛋白基因，转录调节因子基因，细胞骨架蛋白基因和膜转运蛋白基因。其中转录调节因子基因中的HSF4有很重要的作用，对其研究亦有所进步，它在晶状体纤维细胞的生长和成熟等过程中起着重要作用，但是其转录调控的机制还不清楚。近年来发现与白内障有关的突变位点的数量已超过100个。在人体内，通过对一系列ADCC家族进行基因连锁分析发现均存在HSF4b基因的错义突变。在小鼠，通过转基因技术敲除小鼠的HSF4基因，新生小鼠出生后3-5天即出现白内障，可能与晶状体纤维细胞分化和发育异常有关。 HSF4是HSFs即热休克转录因子家族的一个成员，它在外界和内环境等的刺激或者正常生理状态下都可形成三聚体，然后和热休克元件（HSE）结合，激活下游HSP27、HSP70、HSP90以及晶状体蛋白等的表达。HSF4分两不同亚型：HSF4a和HSF4b。前者有转录抑制活性，而后者具有转录激活和抑制双重作用。HSF4b是晶状体内特异表达的亚型。小鼠晶状体HSF4b的缺失降低Hsp25，γ-crystallin和CP49等蛋白的表达。 磷酸化是蛋白质最重要的翻译后修饰之一，，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位，HSF4b在生理条件下即可处于磷酸化状态，也可以受MAP激酶调控发生磷酸化修饰，即HSF4b受P38、JNK和ERKl/2的磷酸化调控发生磷酸化，磷酸化后激活其下游热休克蛋白表达，磷酸化可诱导HSF4b类泛素化，SUM0反过来抑制了HSF4b体外转录活性。HSF4中含有一个PDSM（磷酸化依赖SUMO化修饰基序）模体，PDSM存在于保守两个功能不同的热休克因子家族成员HSF1和HSF4b中间，与SUMO相似，PDSM通过磷酸化依赖SUMO化，发过来抑制了底物的转录活性。HSF4b中的S299丝氨酸处于PDSM模体PASP中，因此我们推测该位点磷酸化后能反过来抑制HSF4b的转录活性。 14-3-3与靶蛋白结合时主要通过识别靶蛋白中的磷酸化丝氨酸/苏氨酸识别序列。根据这些序列模体可以推测某些蛋白质能否和14-3-3蛋白结合，S299位点存在含有丝氨酸的模体，我们猜测它是否与14-3-3相互作用。下一步实验既是利用三个突变体分别与14-3-3共转染观察它们的结合作用，结合下游蛋白的表达量来分析该位点磷酸化后对HSF4b的转录活性调节。 为了进一步了解控制HSF4b转录活性的分子机制，我们就磷酸化调控HSF4b的机制进行探讨，预测可能的蛋白序列磷酸化位点,将其定点突变进行功能研究和机制研究，找到相应的磷酸化激酶和通路。 本实验通过构建HSF4b的突变体，测定HSF4b的转录活性，确定有效的磷酸化位点以及对下游相关基因的调控。 目的 本研究通过构建HSF4b的突变体，测定HSF4b的转录活性，确定有效的磷酸化位点以及HSF4b下游相关基因的调控。 方法 1.应用PCR技术，利用突变引物扩增PWZL-blast-HSF4b(以下简称HSF4b)，产物用DpnⅠ酶切，转化至DH5α中，提取质粒，ECORⅠ初步酶切鉴定，测序。 2.测序证确后，将上述突变质粒转染293T细胞，进行真核表达。利用SDS-PAGE和Western blot实验鉴定HSF4b和Hsp27蛋白的表达，初步确定有效的磷酸化位点。 3.利用HSF4b缺失的晶状体上皮细胞（MLEC-/-），转染突变体质粒，建立稳定株MLEC HSF4b、MLEC HSF4b/S299A、MLEC HSF4b/S299D和MLEC HSF4b/S299E。Western blot实验鉴定HSF4b和Hsp27，alpha B-crystallin等蛋白的表达。 4.通过luciferase assay实验，来验证HSF4b/S299A,HSF4b/S299D, HSF4b/S299E对下游基因α B-晶体蛋白（alpha B-crystallin）的影响。 结果 1.构建了HSF4b的突变质粒HSF4b/S42A、HSF4b/S49A、HSF4b/S66A、HSF4b/S85A、HSF4b/T173A、HSF4b/T221A、HSF4b/S243A、HSF4b/S269A、HSF4b/S278A、HSF4b/S299A、HSF4b/S340A、HSF4b/S372A、HSF4b/S401A、HSF4b/T446A、HSF4b/T471A、HSF4b/S489A、HSF4b/S299D和HSF4b/S299E共18个，测序正确。 2.将上述突变质粒转染293T细胞，Western blot实验鉴定体内Hsp27蛋白的表达结果显示：HSF4b/S66、AHSF4b/S269A、HSF4b/T446A、HSF4b/T471A的Hsp27表达降低，HSF4b/S299A的Hsp27表达升高，其他突变体无明显变化。 3.成功建立了稳定株MLEC/HSF4b、MLEC/HSF4b/S299A、MLEC/HSF4b/S299D和MLEC/HSF4b/S299E三个，Western blot实验证明S299是有效的磷酸化位点，起到了表达抑制作用。 4. Luciferase assay说明了S299A对HSF4b下游αB-晶体蛋白（alpha B-crystallin）有转录激活作用，HSF4b/S299D和HSF4b/S299E对HSF4b下游基因alpha B-crystallin有转录抑制作用。 结论 1.成功建立了HSF4b表达突变体18个。 2.初步确定了5个有效磷酸化位点，其中HSF4b/S66A、HSF4b/S269A、HSF4b/T446A、HSF4b/T471A表现为对下游基因的转录激活作用，HSF4b/S299A表现为转录抑制作用。
【关键词】：热休克转录因子4 定点突变 荧光素酶实验
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3411
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 英文缩略词表(ABBREVIATION)12-13
• 引言13-15
• 1 前言15-17
• 2 材料、试剂与仪器17-27
• 2.1 菌种、载体、细胞来源17
• 2.2 主要试剂17
• 2.3 主要溶液17-25
• 2.4 实验仪器25-27
• 3 方法27-37
• 3.1 引物设计27-28
• 3.2 PCR 克隆 PWZL-blast-HSF4b 突变体基因全长28-29
• 3.3 PCR 产物酶切29
• 3.4 制备感受态细胞与转化29-30
• 3.5 鉴定克隆30
• 3.6 细胞培养与转染30-31
• 3.7 稳定株的建立31-32
• 3.8 细胞收集并裂解32
• 3.9 BCA 法测定各细胞总蛋白浓度32-33
• 3.10 Western blot 实验方法33-34
• 3.11 Luciferase assay 实验方法34-37
• 4 实验结果37-51
• 4.1 PWZL-blast-HSF4b 突变体基因全长的扩增37-39
• 4.2 突变体的酶切鉴定39-42
• 4.3 突变体的测序鉴定42-46
• 4.4 Western blot 结果46-49
• 4.5 luciferase assay 结果49-51
• 5 讨论51-55
• 小结55-57
• 参考文献57-59
• 综述59-69
• 参考文献65-69
• 致谢69-71

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 章文贤;蒋咏梅;贺望兴;郭文燕;黄晓菊;郑素云;;灵芝14-3-3蛋白基因的电子克隆与表达分析[J];华北农学报;2013年05期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 张晶;新型疫苗佐剂—硫酸乙酰肝素刺激DCs后差异蛋白质组学研究[D];北京协和医学院;2013年

2 王泽英;Clusterin基因在奶牛乳腺炎中的作用及表达调控机制[D];南京农业大学;2012年

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本文编号：399576