过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPARα）激活对内质网应激介导的HepG2细胞凋亡的作用研究

发布时间：2017-05-27 10:04

  本文关键词：过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPARα）激活对内质网应激介导的HepG2细胞凋亡的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是不同于死亡受体途径或线粒体损伤途径的第三种细胞凋亡途径。越来越多的研究发现病毒性肝炎、酒精性肝损伤、脂肪肝、肝脏缺血再灌注损伤等肝脏损伤都与内质网应激引起的细胞凋亡有着密切的关系，因此抑制内质网应激、减轻细胞凋亡是防治肝脏损伤的重要环节。过氧化物酶体增殖物激活受体-α（peroxisome proliferator-activated receptor-α, PPARα）是配体激活的核受体PPARs家族的三个亚型之一，参与细胞凋亡的调节。研究表明PPARα的选择性激动剂WY14643可以抑制细胞凋亡，对重要脏器如心脏、肝脏、大脑和肾脏的缺血/再灌注损伤发挥保护作用，而PPARα的选择性拮抗剂MK886可引起细胞凋亡。我们前期研究也表示，WY14643对在体肝脏部分缺血再灌注损伤和大鼠肝细胞缺氧复氧损伤均具有保护作用，而这一作用是否与ERS有关尚未可知，本研究旨在探讨PPARα激活对ERS诱导的人肝癌细胞株(HepG2)凋亡的影响，以阐明其肝脏保护作用的机制。 方法首先，为明确诱导HepG2细胞凋亡的最适过氧化氢（H_2O_2）浓度，选择0.1mM、1mM、3mM的H_2O_2刺激HepG2细胞6小时，，并分别设置control组、WY14643alone组、DMSO alone组、WY14643预先给药组和DMSO预先给药组对比，采用MTT比色法和DAPI-PI双染法检测各组细胞活力；然后，根据上述实验结果选择最适的H_2O_2作用浓度，设置control组、DMSO alone组、WY14643alone组、H_2O_2alone组、WY14643+H_2O_2组和DMSO+H_2O_2组，采用赖氏法检测各组细胞培养上清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）活性， TBA法检测各组HepG2细胞丙二醛（MDA）含量， RT-PCR法检测内质网应激标志分子BiP和CHOPmRNA转录水平，WB法检测PPARα、BiP和CHOP蛋白质表达水平，观察WY14643对H_2O_2诱导的内质网应激反应的影响；最后，设置DMSO alone组、MK886alone组、H_2O_2alone组、WY14643+H_2O_2组和MK886+WY14643+H_2O_2组，采用赖氏法检测各组细胞培养上清液ALT和AST活力，TBA法检测细胞MDA含量，RT-PCR法检测BiP和CHOP mRNA转录水平，WB法检测PPARα、BiP和CHOP蛋白质表达水平，Annexin V-FITC/PI双染法检测各组细胞调亡率，免疫荧光法观察CHOP蛋白质在各组细胞内定位及表达量，明确WY14643的作用是否依赖于PPARα的激活。统计学处理：采用SPSS16.0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（x—±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P 0.05为差异有统计学意义。 结果MTT比色法和DAPI-PI双染法显示，与对照组比较，DMSO alone组、WY14643alone组和0.1mM H_2O_2均不改变细胞活力，而1mM H_2O_2组和3mMH_2O_2组细胞活力明显降低（P 0.05）；与1mM H_2O_2组，WY14643+1mM H_2O_2组细胞活力分别由59.6%±9.6%和56.1%±5.6%提高至92.6%±14.2%和96.4%±3.8%（P 0.05），DMSO+1mM H_2O_2组细胞活力无明显变化；和3mM H_2O_2组相比，WY14643+3mM H_2O_2组细胞活力分别由30.2%±3.5%和32.0%±4.7%提高至45.6%±4.0%和52.8%±6.0%（P 0.05），DMSO+3mM H_2O_2组细胞活力无明显变化。因此，后续试验H_2O_2作用浓度均选择1mM。 与control组相比，H_2O_2alone组细胞培养上清液ALT和AST活力增强（P 0.05），细胞MDA含量增加（P 0.05），BiP和CHOP mRNA转录水平上调（P 0.05）， PPARα、BiP和CHOP蛋白质表达水平显著上调（P 0.05），而WY14643alone组除PPARα蛋白质表达水平上调外，其余指标均无明显变化， DMSO alone组各项指标均无明显变化；而与H_2O_2alone组相比，WY14643+H_2O_2组细胞培养上清液ALT和AST活力显著下降（P 0.05），细胞MDA含量降低（P 0.05），BiP和CHOP mRNA转录水平下调（P 0.05），BiP和CHOP蛋白质表达水平下调（P 0.05），而DMSO+H_2O_2组则无明显变化。 与DMSO alone组相比，H_2O_2alone组细胞培养上清液ALT和AST活力增强（P 0.05），细胞MDA含量增加（P 0.05），BiP和CHOP mRNA转录水平上调（P 0.05），PPARα、BiP和CHOP蛋白质表达水平上调（P 0.05），MK886alone组和MK886+WY14643+H_2O_2组细胞培养上清液ALT和AST活力增强（P 0.05），细胞MDA含量增加（P 0.05），BiP和CHOP mRNA转录水平上调（P 0.05），BiP和CHOP蛋白质表达水平上调（P 0.05），而PPARα蛋白质表达显著下调（P0.05）；与H_2O_2alone组相比，WY14643+H_2O_2组细胞培养上清液ALT和AST活力显著下降（P 0.05），细胞MDA含量降低（P 0.05），BiP和CHOP mRNA转录水平下调（P 0.05）， BiP和CHOP蛋白质表达水平下调（P 0.05）；与WY14643+H_2O_2组相比，MK886+WY14643+H_2O_2组细胞培养上清液ALT和AST活力增强（P 0.05），细胞MDA含量增加（P 0.05），BiP和CHOP mRNA转录水平上调（P 0.05）， BiP和CHOP蛋白质表达水平上调（P 0.05），而PPARα蛋白质表达显著下调（P 0.05）。 流式细胞术检测发现，与control组相比，H_2O_2alone组和MK886alone组细胞凋亡率显著上升（P0.05），而WY14643alone组则无明显变化；与H_2O_2alone组相比，WY14643+H_2O_2组细胞凋亡率明显下降（P0.05）；而与WY14643+H_2O_2组相比，MK886+WY14643+H_2O_2组细胞凋亡率又显著性回升（P0.05）。最后，观察到control组CHOP蛋白质均位于细胞质；而与control组相比，H_2O_2alone组和MK886alone组CHOP蛋白质表达增加，且大部分位于细胞核；与H_2O_2alone组相比，WY14643+H_2O_2组CHOP表达显著减少，且主要居于细胞质；而与WY14643+H_2O_2组相比，MK886+WY14643+H_2O_2组CHOP表达现在增加，主要定位于细胞核。 结论WY14643可以激活PPARα，减少H_2O_2引起的HepG2细胞凋亡，改善HepG2细胞肝功能，作用机制可能通过抑制内质网应激反应途径抑制细胞凋亡，而这种保护效应可以被MK886拮抗；并且MK886本身可以引起内质网应激，诱导HepG2细胞凋亡。
【关键词】：PPARα 氧化应激 内质网应激 细胞凋亡 肝损伤
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要9-13
• Abstract13-17
• 1 前言17-18
• 2 实验材料18-22
• 2.1 细胞株18
• 2.2 抗体18-19
• 2.3 主要试剂来源及配制19-20
• 2.4 引物设计和合成20-21
• 2.5 实验仪器21-22
• 3 实验方法22-34
• 3.1 实验分组22-23
• 3.2 细胞培养23-24
• 3.3 MTT 法检测细胞活力24
• 3.4 DAPI-PI 双染法检测细胞活力24-25
• 3.5 HepG2 细胞培养上清液 ALT 测定（赖氏法）25-26
• 3.6 HepG2 细胞培养上清液 AST 测定（赖氏法）26-27
• 3.7 HepG2 细胞内 MDA 含量测定（TBA 法）27-28
• 3.8 流式细胞术28-29
• 3.8.1 Annexin V-FITC/PI 双染检测细胞调亡原理28-29
• 3.8.2 操作流程29
• 3.9 RT-PCR29-31
• 3.9.1 RNA 提取29-30
• 3.9.2 RT 反应30-31
• 3.9.3 PCR 扩增31
• 3.9.4 凝胶电泳和定量分析31
• 3.10 蛋白质印迹（Westernblotting，WB）31-33
• 3.10.1 蛋白样品制备31-32
• 3.10.2 SDS-PAGE 凝胶制备32
• 3.10.3 上样电泳32
• 3.10.4 转膜32-33
• 3.10.5 WB 检测33
• 3.11 细胞免疫荧光染色33
• 3.12 统计学处理33-34
• 4 结果34-45
• 4.1 WY14643 对 HepG2 细胞活力的影响34-36
• 4.1.1 MTT 法34-35
• 4.1.2 DAPI-PI 双染法35-36
• 4.2 PPARα对 HepG2 细胞肝功能的影响36-38
• 4.3 PPARα对 HepG2 细胞 MDA 水平的影响38-39
• 4.4 PPARα对 HepG2 细胞凋亡率的影响（流式细胞术）39-40
• 4.5 PPARα对 HepG2 细胞内质网应激相关分子 BiP 和 CHOP mRNA表达的影响40-42
• 4.6 PPARα对 HepG2 细胞 PPARα及内质网应激相关分子 BiP 和CHOP 蛋白质表达的影响42-44
• 4.7 PPARα对 HepG2 细胞内 CHOP 定位的影响44-45
• 5 讨论45-46
• 6 结论46-47
• 7 本研究的创新点47
• 8 展望47
• 9 参考文献47-52
• 附录52-53
• 致谢53-54
• 综述54-63
• 参考文献62-63

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