重组人mda-7/IL-24的异源表达、包涵体复性及分离纯化的研究

发布时间：2024-07-06 08:10

　　白细胞介素-24(IL-24),又名黑色素瘤分化相关基因-7(mda-7), mda-7/IL-24是一种广谱性抗肿瘤药物,可以选择性摧毁肿瘤细胞但是对正常细胞或者组织没有伤害。 本论文选取E.coli BL21(DE3)为宿主菌,pET-28a(+)为表达载体,成功实现了mda-7/IL-24的异源构建与表达,蛋白表达量约为29.6%,重组蛋白为包涵体。 包涵体的变复性。探讨了不同浓度的尿素、盐酸胍及精氨酸的添加对mda-7/IL-24包涵体的溶解效果,优化后的变性缓冲液为20mM Tris,10mM EDTA,8M urea, pH9.5。经6次不同缓冲液逐步透析复性：尿素浓度递减(6M-3M-1.5M-0.75M-0M-0M),pH梯度逐渐减少(9.5-9.0-8.5-8.0-7.5-7.4),静水压采用0.5-1.0kPa,添加还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽10：1,甘油浓度递减(20%-15%-10%-5%-0%-0%),最终得到溶于PBS中的IL-24蛋白。 本论文还优化了发酵条件以改善包涵体结构。优化所得的结果为：培养基配方为MgSO41.88g/L, CaCl21.84...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1.1IL-10家族在1号染色体上的位置

图2.1pET-28a(+)的质粒图谱Fig.2.1themapofpET-28a(+)vector

图1.2IL-IO家族成员一级结构

图2.4PCR法验证阳性克隆的凝胶电泳图Fig.2.4agaroseelectrophoresisofverificationofpositiveclonebyPCRM:DNAMaker；1-7:阳性单克隆菌落PCR产物性克隆菌的测序分析

图1.3inda-7/IL-24空间结构模式图

3:诱导后菌种裂解液沉淀4:诱导后菌种裂解液上清表达rnda-7/IL-24目的蛋白的Westernblot检验如图2.7，可以看出重组蛋白可以与mda-7/IL-24抗体发生反应

图1.4IL-24介导细胞凋亡的可能的途径Fig.1.4ModelillustratingthepossiblemolecularbasisofIL-24cancercell-mediatedapoptosis

间的相互作用，减少复性中蛋白的再聚集。但本实验中，先纯化后复性的方法却不是很理想，如图3.5所示中的泳道1、2和9，可以看到上样后大部分的蛋白都穿出了，也就是大部分的mda-7/IL-24蛋白没有与镍亲和层析柱结合。为了提高挂柱量，将样品循环上样，发现5次循环后，样品蛋白仍旧大量....

本文编号：4002308