人羊膜上皮细胞干预脂多糖诱导RAW264.7细胞向M1极化及其机制初步研究

发布时间：2017-05-27 23:09

  本文关键词：人羊膜上皮细胞干预脂多糖诱导RAW264.7细胞向M1极化及其机制初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的探讨人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cell, H-AEC)预防RAW264.7细胞在脂多糖(1ipopolysaccharide, LPS)诱导后向M1极化的作用和可能机制以及比较H-AEC、羊膜间充质细胞(human amniotic mesenchymal cell, HA-MSC)和脐带间充质细胞(Umbilical mesenchymal stem cells, UC-MSC)分泌的细胞因子对脂多糖刺激巨噬细胞系RAW264.7炎症状态的影响。为H-AEC在治疗炎症相关疾病的临床应用上提供理论基础。 方法 细胞的分离和培养：通过胰酶(Trypsin/EDTA,T/E)消化法作用人胎盘羊膜,分离H-AEC；通过透明质酸酶(Hyaluronidase, H),中性蛋白酶(Dispase, D)以及胶原蛋白酶(Collagenase,C)三酶联合消化法分别从人胎盘羊膜和脐带中分离HA-MSC和UC-MSC。 实验分组：(1)H-AEC干预LPS刺激RAW264.7极化实验分组：①空白对照组：RAW264.7正常培养48小时；②阳性对照组：RAW264.7正常培养48小时后100ng/ml LPS刺激4小时；③干预对照组：AW264.7(2.5×105)和H-AEC (5×105) Transwell共培养48小时；④实验组:RAW264.7(2.5×105)和H-AEC (5×105) Transwell共培养48小时后100ng/ml LPS刺激4小时。 (2)比较H-AEC、HA-MSC、UC-MSC干预LPS刺激RAW264.7极化实验分组：①阳性对照组：RAW264.7正常培养48小时后100ng/ml LPS刺激4小时；②H-AEC组：RAW264.7(2.5×105)和H-AEC (5×105) Transwell共培养48小时后100ng/ml LPS刺激4小时；③HA-MSC组：RAW264.7(2.5×105)和A-MSC(5×105)Transwell共培养48小时后100ng/ml LPS刺激4小时；④UC-MSC组：RAW264.7(2.5×105)和UC-MSC (5×105) Transwell共培养48小时后100ng/ml LPS刺激4小时。 检测方法：细胞划痕实验检测各组RAW264.7细胞的迁移能力；一氧化氮检测试剂盒检测各组RAW264.7细胞分泌NO的水平；用实时定量多聚酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)检测各组细胞经典激活的巨噬细胞(classically activated macrophage, M1macrophage)相关的促炎基因以及旁路活化的巨噬细胞(alternatively activated macrophage, M2macrophage)相关的抑炎基因表达情况；Western blotting检测(1)中各组RAW264.7胞质蛋白p-IκBa以及胞核蛋白NFκB的表达；ELISA检测各组TGF-p1的分泌情况。 结果(1)实验组RAW264.7细胞迁移率为14.7%±4.5%,与阳性对照组(31.1%±11.0%)相比,差异具有显著性(p0.05)。HA-MSC、UC-MSC组迁移率分别为14.7%±4.5%、9.6%±0.7%、13.0%±0.9%,与阳性对照组相比,差异具有显著性(p0.05),但三组实验组无明显差异(p0.05)。(2)实验组共培养后RAW264.7细胞分泌NO的水平为24.26±0.72μM/L,与阳性对照组(45.65±1.78μM/L)差异具有显著性(p0.05)。 HA-MSC、UC-MSC组NO浓度为44.52±2.51μM/L、42.25±0.76μM/L,与阳性对照组无显著性差异(p0.05)。(3)促炎基因与抑炎基因的表达改变：(A)实验组(H-AEC组)IL-1β、TNFa、NOS-2、INFβ等M1基因表达下调,CD206、CD36、Arg-1等M2基因表达上调,与阳性对照组相比有显著差别；(B)HA-MSC、UC-MSC组促炎基因INFp表达下调显著,其余基因均上调表达；抑炎相关基因如Arg-1、CD206、CD36均上调；三组细胞干预后抑炎症相关基因Arg-1、CD206、CD36表达均上调,与对照组有显著差异。(4)实验组降低了RAW264.7细胞中LPS激活的经典炎性通路NFκB上胞质蛋白p-IκBa以及胞核蛋白NFκB的表达量。(5)实验组下室TGF-p1分泌量大于上室,两者都大于H-AEC自身TGF-β1分泌量。 结论人羊膜上皮细胞能有效抑制LPS刺激下的RAW264.7向M1极化且M2相关基因表达上调,其机制可能是通过抑制IκBa磷酸化阻止NFκB进入细胞核内启动M1型相关基因的表达。人羊膜上皮细胞、羊膜间充质细胞和脐带间充质细胞可以促进巨噬细胞向2型分化,但其效果和机制存在不同。
【关键词】：羊膜上皮细胞 羊膜间充质细胞 脐带间充质细胞 脂多糖 M1巨噬细胞 M2巨噬细胞
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 中英文对照12-13
• 前言13-16
• 1 羊膜上皮细胞以及间充质细胞具有减轻炎症和调节免疫的作用13
• 2 巨噬细胞的极化表型及相应的功能特征13-14
• 3 巨噬细胞极化现象与疾病的关系14
• 4 H-AEC作用巨噬细胞的可能途径14-16
• 第一章 H-AEC、HA-MSC、UC-MSC的分离、鉴定和培养16-22
• 1 材料和方法16-20
• 1.1 材料与试剂16-17
• 1.2 试剂配制17
• 1.3 主要仪器17-18
• 1.4 分离、鉴定、培养的方法18-20
• 2 结果20
• 3 讨论20
• 4 结论20-21
• 附图21-22
• 第二章 人羊膜上皮细胞干预脂多糖刺激的RAW264.7细胞向M1极化及其初步机制22-35
• 1 材料和方法22-28
• 1.1 材料与试剂22-23
• 1.2 试剂配制23-24
• 1.3 主要仪器24-25
• 1.4 实验方法25-28
• 2 结果28-29
• 2.1 RAW264.7细胞的鉴定28
• 2.2 RAW264.7细胞迁移率实验组和阳性对照组有统计学差异28
• 2.3 羊膜上皮细胞能减少LPS刺激下RAW264.7 NO的分泌28
• 2.4 H-AEC能使LPS刺激下的M1型RAW264.7转变为M2型28-29
• 2.5 H-AEC可能通过抑制NFKB通路抑制RAW264.7 M1型相关基因的表达29
• 2.6 H-AEC可能通过分泌TGF-β1抑制RAW264.7 M1型相关基因或促进M2型相关基因表达29
• 3 结论29
• 4 讨论29-31
• 附图31-35
• 第三章 三种成体干细胞对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症状态的不同作用比较35-42
• 1 材料和方法35-37
• 1.1 材料和试剂35-36
• 1.2 主要仪器36
• 1.3 实验方法36-37
• 2 结果37-38
• 2.1 H-AEC、HA-MSC、UC-MSC处理对RAW264.7迁移率的影响37
• 2.2 HAEC共培养后能降低LPS刺激的RAW264.7分泌NO37
• 2.3 H-AEC、HA-MSC、UC-MSC处理对RAW264.7细胞M1、M2相关基因表达的不同作用37-38
• 3 结论38
• 4 讨论38-40
• 附图40-42
• 参考文献42-46
• 综述46-52
• 参考文献49-52
• 攻读学位期间主要的研究成果52-53
• 致谢53

【共引文献】

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1 Xiao-Yong Liu;Jian Chen;Qing Zhou;Jing Wu;Xiao-Ling Zhang;Li Wang;Xiao-Yan Qin;;In vitro tissue engineering of lamellar cornea using human amniotic epithelial cells and rabbit cornea stroma[J];International Journal of Ophthalmology(English Edition);2013年04期

2 Min Yao;Jian Chen;Xiao-Xi Yang;Xiao-Ling Zhang;Qing-Shan Ji;Qing Zhou;Jin-Tang Xu;;Differentiation of human amniotic epithelial cells into corneal epithelial-like cells in vitro[J];International Journal of Ophthalmology(English Edition);2013年05期

3 刘新;娄金丽;孙桂珍;;巨噬细胞在肝纤维化中的调控作用[J];北京医学;2014年03期

4 何妲;彭琳;黄生建;陆文玲;王建;;三种成体干细胞对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症状态的影响[J];南方医科大学学报;2014年11期

5 田维毅;葛金文;;M1/M2型巨噬细胞极化对动脉粥硬化炎症影响的研究进展[J];贵阳中医学院学报;2014年06期

6 于永忠;王欢;谭强;赵文博;崔玉东;;人羊膜上皮细胞对于生长因子和ORFV的敏感性研究[J];黑龙江八一农垦大学学报;2013年04期

7 王钰莹;方宁;陈代雄;余丽梅;赵春华;;人羊膜上皮细胞原位移植对大鼠急性心肌梗死后心功能和心室重构的改善作用[J];临床心血管病杂志;2014年02期

8 刘志;黄允宁;;生理状态下大鼠大网膜Ⅰ型与Ⅱ型乳斑内CD68、CD163阳性巨噬细胞数量对比研究[J];宁夏医学杂志;2014年02期

9 杨闯;柯星;张淑平;张晓洁;;THP-1源性巨噬细胞对卵巢癌SKOV3细胞Toll样受体mRNA表达的影响[J];临床检验杂志;2014年04期

10 王平;刘邦忠;刘光华;石明芳;杨名珍;陆志辉;;不同浓度维甲酸诱导体外培养人羊膜上皮细胞分化为神经样细胞的研究[J];中国临床神经科学;2014年03期

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1 戴菱菱;巨噬细胞的替代激活抑制脂毒性引起的巨噬细胞死亡[D];中南大学;2013年

2 崔丽娜;间充质干细胞肝向分化特异性microRNA表达谱的鉴定及功能学研究[D];第四军医大学;2013年

3 苏莎莎;Mir-10b调节K1f4介导的巨噬细胞极化并抑制T_H1T_H17细胞反应[D];南方医科大学;2014年

4 周碧玉;小鼠脾组织和脾T细胞亚群的增龄性变化及骨髓间充质干细胞移植对其的影响[D];北京协和医学院;2014年

5 崔丽娜;间充质干细胞肝向分化特异性microRNA表达谱的鉴定及功能学研究[D];第四军医大学;2013年

6 刘宗正;绵羊间充质干细胞系的建立及用作体细胞克隆供体的研究[D];内蒙古农业大学;2014年

7 聂少麟;miRNA-25靶向调控ANGPTL2抑制结肠癌细胞增殖和侵袭的研究[D];中南大学;2014年

8 周励;大鼠雌性生殖干细胞建系、生物学特性研究与应用[D];上海交通大学;2014年

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1 李变锋;高脂高糖诱导妊娠期胰岛素抵抗大鼠模型的建立与评价及饮食干预对其的影响[D];郑州大学;2013年

2 王莎莎;替米沙坦对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏及大网膜组织中抵抗素表达的影响[D];河北医科大学;2013年

3 冯国纹;人羊膜及其联合rhEGF凝胶治疗皮肤III度烧伤的实验研究[D];遵义医学院;2013年

4 袁璐萍;急性肝损伤小鼠体中移植细胞的动态分布研究[D];浙江中医药大学;2013年

5 姚敏;体外诱导人羊膜上皮细胞分化为角膜上皮样细胞的实验研究[D];暨南大学;2013年

6 邱爽;山羊羊水来源干细胞EGFP基因转化及向神经细胞分化的研究[D];西北农林科技大学;2013年

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8 屈芳;大鼠骨骼肌损伤修复过程中TNF-α的变化研究[D];上海体育学院;2013年

9 寻权;人羊膜上皮细胞移植治疗肝硬化大鼠的初步研究[D];中南大学;2013年

10 赵晓涛;3D黏附下DISH骨化相关特异性microRNA分析[D];天津医科大学;2011年

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本文编号：401400