Neuritin慢病毒修复大鼠受损视神经和RGC5的作用及机制

发布时间：2017-05-28 17:00

  本文关键词：Neuritin慢病毒修复大鼠受损视神经和RGC5的作用及机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 视神经损伤是目前许多临床眼部疾病和外伤治疗的难点。视网膜神经节细胞（Retinal Ganglion Cells，RGCs）的丢失及再生困难，是视神经损伤导致视神经萎缩和失明的关键因素，如何进行有效的逆转治疗一直是眼科和神经科学领域面临的难题之一。Neuritin又名可塑性相关候选基因15（candidate plasticity-related gene15，CPG15），是神经营养因子家族中的新成员。Neuritin主要表达于神经系统中，Neuritin是神经营养因子和神经活动发挥作用的共同下游因子，在抑制神经细胞凋亡、促进轴突生长、促进突触成熟和调节突触可塑性等方面均具有重要作用。 本实验基于Neuritin独特的神经营养作用及其在神经创伤、疾病中的变化和作用，研究视神经损伤后Neuritin基因在视网膜和视神经中的表达变化，并以Neuritin为靶进行治疗，推测其对RGCs的存活和再生这一视神经损伤和疾病的关键环节具有明显的作用，将有助于进一步揭示视神经再生难的原因和探讨视神经修复的新方法。方法： （1）视神经夹伤模型的制作：用Yasargil脑动脉瘤夹于成年雄性大鼠视神经眼球后约1mm处夹伤9s，模拟临床造成视神经不完全损伤。采用HE染色、CTB追踪、透射电镜观察等方法观察视神经夹伤后视神经的形态变化。 （2）观察Neuritin在视神经损伤后视网膜和视神经中的时空表达变化：应用免疫荧光双标的方法检测Neuritin在组织细胞中的定位，再分别应用Western blot和Real time PCR的方法检测视神经损伤后Neuritin在蛋白和mRNA水平的表达变化。 （3）构建Neuritin慢病毒质粒并包装测定其滴度。 （4）体内观察Neuritin过表达对受损大鼠RGCs及视神经的作用：大鼠视神经夹伤前1周玻璃体注射Neuritin慢病毒，损伤2周后采用CTB顺行标记RGCs以观察其存活及轴突的再生情况。 （5）体外观察Neuritin蛋白或过表达对视网膜神经节细胞系（Retinal GanglionCell-5, RGC5）的作用及机制：采用CCK8法或MTT法检测Neuritin蛋白对受损RGC5存活的影响，相差显微镜拍照观察Neuritin过表达对RGC5突起长度的影响，DAPI染色和Western blot方法分别检测Neuritin对RGC5细胞凋亡的影响；进一步通过Western blot检测神经营养因子相关信号通路关键分子pSTAT3、pAKT和pERK的表达。 结果： （1）正常视网膜及视神经中Neuritin蛋白的表达定位：免疫荧光双标的结果显示在正常视网膜中Neuritin蛋白主要表达于RGCs胞体和突起及部分星形胶质细胞中；正常视神经中Neuritin蛋白主要表达于RGCs轴突、少突胶质细胞及血管内皮细胞中。 （2）成功建立视神经不完全损伤模型：HE染色结果显示视神经损伤后损伤区神经外膜保持完整，CTB追踪结果显示神经损伤后远侧端仍保留有正常运输功能的轴突，透射电镜结果显示视交叉前段视神经仍保留有正常样轴突。 （3）视神经受损后Neuritin在视网膜和视神经中的时空表达变化规律：Westernblot显示视神经受损后1d Neuritin蛋白在视网膜及视神经中表达升高，，伤后3d、7d均高表达，其后缓慢下调至正常水平，Real time PCR的结果显示伤后1d NeuritinmRNA瞬时表达高表达，其后下调至或低于正常水平。 （4）成功构建Neuritin慢病毒质粒，并获得高滴度的Neuritin慢病毒颗粒。 （5）体内Neuritin过表达对受损大鼠RGCs及视神经的作用：损伤后2周Neuritin过表达组RGCs的存活明显增加，存留及再生的轴突显著增多。 （6）体外Neuritin蛋白及过表达对RGC5的作用及机制：CCK8法结果显示重组的人Neuritin蛋白可增加受损RGC5的存活，Neuritin过表达可增加RGC5最长突起的长度；DAPI染色及Caspase3表达的检测显示Neuritin过表达可以减少受损RGC5细胞的凋亡及活化型Caspase3的表达。神经营养因子相关信号通路的检测显示Neuritin过表达可下调pSTAT3蛋白的表达，并上调pAKT和pERK蛋白的表达。 结论： （1）Neuritin在正常视网膜中主要表达于RGCs及部分星形胶质细胞中，在视神经中主要表达于RGCs轴突、少突胶质细胞及血管内皮细胞。 （2）采用Yasagil脑动脉瘤夹夹伤视神经，可建立视神经不完全损伤模型。 （3）视神经损伤早期视网膜及视神经内Neuritin的高表达，而后期Neuritin表达的不足提示可能为RGCs大量死亡和轴突再生失败的原因之一。 （4）体内实验初步证实Neuritin过表达对视神经损伤后的RGCs有保护作用，可以有效促进RGCs的存活及其轴突的再生。 （5）体外实验证明Neuritin慢病毒或蛋白可促进受损RGC5的存活，抑制细胞凋亡并促进突起的生长。上述作用可能是通过抑制STAT3通路并激活AKT和ERK信号通路实现的。
【关键词】：Neuritin 视神经 视网膜节细胞 损伤 基因治疗 神经修复
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 缩略词表11-13
• 第一部分 Neuritin 在视神经损伤后视网膜和视神经中的表达变化13-36
• 一、前言13-15
• 二、实验材料15-17
• 三、实验方法17-25
• （一）组织学切片17-18
• （二）免疫组织化学18
• （三）免疫荧光组织化学18-19
• （四）动物模型的制作19-20
• （五）伊红苏木素（HE）染色20
• （六）视神经顺行束路追踪20-21
• （七）透射电子显微镜观察21
• （八）免疫印迹法(Western blot)21-23
• （九）实时荧光定量 PCR23-24
• （十）统计学分析24-25
• 四、结果25-32
• （一） Neuritin 在正常视网膜和视神经中的表达定位25-28
• （二）动物模型的建立28-31
• （三） Neuritin 在视神经损伤后视网膜和视神经中的表达变化31-32
• 五、讨论32-36
• （一） Neuritin 在正常视网膜和视神经中的表达定位32-34
• （二）建立视神经不完全损伤模型34
• （三）Neuritin 在视神经受损后视网膜及视神经中的表达变化34-36
• 第二部分 Neuritin 慢病毒对受损视神经和 RGC5 的修复作用及机制36-77
• 一、前言36
• 二、实验材料36-41
• 三、实验方法41-52
• （一）目的基因片段获取41-42
• （二）慢病毒载体及 Nrn1 基因的酶切连接和转化42-44
• （三）Nrn1 基因慢病毒质粒的抽提及鉴定44-45
• （四）病毒包装细胞 293T 细胞的培养45-46
• （五）慢病毒生产及滴度测定46-47
• （六）动物实验分组47-48
• （七）视神经损伤形态学指标检测48
• （八）RGC5 的培养及诱导分化48
• （九）RGC5 损伤模型的建立48-49
• （十）RGC5 损伤后 Neuritin 表达变化的检测49
• （十一）Neuritin 基因过表达及实验分组49-50
• （十二）细胞存活率的检测50
• （十三）细胞突起长度的检测50
• （十四）细胞凋亡的检测50-51
• （十五）神经营养因子相关信号通路蛋白表达的检测51
• （十六）统计学分析51-52
• 四、结果52-72
• （一）Neuritin 慢病毒重组质粒的构建52-55
• （二）Neuritin 慢病毒重组病毒的包装55-57
• （三）Neuritin 对受损视神经的作用57-60
• （四）Neuritin 在体外对 RGC5 的作用及机制60-72
• 五、讨论72-77
• （一）慢病毒基因治疗72-73
• （二）Neuritin 慢病毒载体对大鼠视神经损伤的修复作用73
• （三）RGC5 损伤模型的建立73-74
• （四）Neuritin 蛋白或者过表达对受损 RGC5 的保护作用74-75
• （五）Neuritin 保护作用的可能作用机制75-77
• 全文小结77-78
• 创新点及意义78-79
• 附录79-81
• 参考文献81-86
• 综述86-94
• 参考文献92-94
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明94-95
• 致谢95-96

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李乐翔;赵永更;张磊;费舟;;Neuritin基因在胶质瘤组织中的表达研究[J];中华神经外科疾病研究杂志;2009年05期

  本文关键词：Neuritin慢病毒修复大鼠受损视神经和RGC5的作用及机制，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：403024