MSX1、PAX9、DLX1基因的克隆及共表达载体的构建

发布时间：2017-05-28 16:11

  本文关键词：MSX1、PAX9、DLX1基因的克隆及共表达载体的构建，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：牙齿发育是口腔上皮和神经嵴来源的间充质相互诱导的过程,是十分复杂并受到精密调控的,多种信号分子、受体、转录因子参与其中,构成时间和空间上复杂的网络体系,调控着牙齿发育的进程。DPSC是由Gronthos等从成人牙齿中酶消化法分离出高度增殖的一类细胞,有较高的克隆形成率。DPSC具有多向分化潜能,在不同微环境下可以分化成不同细胞,最显著的特征就是分化成成牙本质细胞,以牙髓干细胞为种子细胞的牙齿修复技术成为近年来牙齿再生工程的研究热点,细胞分化过程中多种信号分子、转录因子、生长因子的调控,这些分子调控机制共同决定细胞分化的方向,其中一些具有同源盒结构的转录因子如：Msx、Gil、Pax、Barx等,通过调控靶基因的转录在细胞定向分化和诱导过程中发挥了关键性的作用。本研究从正畸牙中分离和培养DPSC,体外成功诱导成骨细胞和成脂肪细胞,证实了DPSC具有多向分化潜能的特性,提取20W人牙胚RNA,逆转录为单链的cDNA, RT-PCR克隆DLX1cDNA序列,确定人牙胚中表达的DLX1转录子亚型为亚型I,原位杂交检测DLXl转录子在人磨牙发育不同时期的表达模式,DLX1在11w、14W、17W在间充质和上皮都有表达、到20W强烈表达在内釉上皮中。构建由人巨细胞病毒启动子(PhCMV)多克隆位点MCS-开放阅读框ORF-终止序列SV40polyA组成的表达盒,由ORF引入MSX1、PAX9、DLX1cDNA序列,最终构建pCMV'-MSX1-PAX9-DLX1串联的共表达载体,并进行功能的验证,瞬时转染到DPSC中,检测DPSC分化情况,DPSC向成牙本质细胞分化的特异性指标是表达牙本质唾液磷蛋白(DSPP),成骨分化的标记基因是RUNX2和OST4, RT-PCR检测表达量上升,而DSPP没有表达,说明DPSC经过诱导后向成骨方向分化而没有向成牙本质细胞方向分化。
【关键词】：牙髓干细胞 多基因共表达载体 瞬时转染 成骨
【学位授予单位】：福建师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要2-3
• Abstract3-5
• 中文文摘5-7
• 目录7-10
• 绪论10-22
• 一、牙齿的发育10-15
• 1. 小鼠和人的牙齿发育过程10-11
• 2. 哺乳动物牙齿发育的分子机制11-15
• 二、多基因共表达系统的研究进展15-18
• 1. 单启动子多基因(多顺反子)系统16-17
• 2. 单基因多载体共表达系统17
• 3. 多重转录单元多基因系统17-18
• 三、牙髓干细胞为基础的牙齿再生的研究进展18-20
• 四、本实验研究的目的和意义20-22
• 第一章 材料和方法22-38
• 1.1 实验材料22-27
• 1.1.1 实验材料的来源22
• 1.1.2 菌株、质粒和细胞22
• 1.1.3 实验仪器22-23
• 1.1.4 实验试剂23
• 1.1.5 实验试剂配方23-26
• 1.1.6 PCR引物26-27
• 1.2 实验方法27-38
• 1.2.1 质粒的改造27-32
• 1.2.2 cDNA克隆32
• 1.2.3 RNA探针制备32-33
• 1.2.4 原位杂交检测33-34
• 1.2.5 牙髓干细胞的分离和培养34-35
• 1.2.6 细胞的复苏、培养、传代和冻存35
• 1.2.7 脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染步骤35-36
• 1.2.8 细胞总蛋白提取36
• 1.2.9 Western blot36-38
• 第二章 实验结果38-54
• 2.1 人牙胚表达的DLX1为转录子亚型138-40
• 2.2 DLX1转录因子在人牙胚发育过程中的表达检测40
• 2.3 MSX1、PAX9、DLX1共表达载体的构建40-46
• 2.3.1 改造质粒示意图40-41
• 2.3.2 pEcoRI~+的构建41-42
• 2.3.3 pCMV的构建42-43
• 2.3.4 MSXl片段的获得43
• 2.3.5 构建pCMV-MSX1、pCMV-PAX9、pCMV.DLXW143-44
• 2.3.6 构建pCMV-MSX1-PAX9-DLX1质粒44-45
• 2.3.7 构建pCMV~--MSX1-PAX9-DLX1质粒45-46
• 2.4 多基因共表达对DPSC分化的影响46-54
• 2.4.1 牙髓干细胞分离和培养47
• 2.4.2 牙髓干细胞多向分化潜能的鉴定47-48
• 2.4.3 优化转染条件,确定转染时间48-49
• 2.4.4 优化转染条件,调整DNA/lipo 2000剂量比49-50
• 2.4.5 脂质体转染共表达载体到DPSC、hEDMC、ihEDMC4初步检测MSX1、PAX9、DLX1的表达50-52
• 2.4.6 脂质体转染DPSC,2W后收获细胞,检测DPSC分化方向52-54
• 第三章 分析和讨论54-58
• 3.1 多基因共表达载体的构建54-55
• 3.2 目的基因转入受体细胞55-56
• 3.3 共表达载体对DPSC分化的影响56-57
• 3.4 本实验的研究展望57-58
• 第四章 结论58-60
• 附录160-62
• 附录262-64
• 附录364-66
• 附录466-68
• 参考文献68-76
• 致谢76-78

【共引文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 王琳;静电纺丝技术构建丝素/胶原/有机高分子聚合物组织工程支架的初步研究[D];兰州大学;2014年

2 何颖;小鼠牙胚在肾包膜及口腔颊黏膜下成牙能力的对比研究[D];暨南大学;2014年

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本文编号：403007