与小型非编码RNA相关的血吸虫基因操作技术研究

发布时间：2017-05-28 21:03

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【摘要】：血吸虫属于扁形动物门裂体吸虫纲,感染后所引起的血吸虫病是仅次于疟疾的世界第二大寄生虫疾病。血吸虫病的急性症状包括尾蚴皮炎和一系列超敏反应,而慢性血吸虫感染往往造成泌尿系统或肝肠部位的病理损伤。目前,针对三种主要血吸虫病病原(曼氏血吸虫、日本血吸虫和埃及血吸虫)的基因组、转录组学研究已经取得了一定进展,下一步的工作将是针对那些组学揭示的蛋白编码基因或具有调控功能的小RNA基因进行功能研究。RNA干扰(RNAi)是一类发生于真核细胞或病毒中的由双链RNA诱导产生的基因沉默现象,siRNA与miRNA代表了两种主要的RNAi诱发因子。siRNA通常作为一种反向遗传学工具被用于蛋白编码基因的功能研究,miRNA则是一种内源的基因表达调控分子,在不同生物体中具有重要的生理功能。本研究将围绕siRNA和miRNA这两种小型非编码RNA分子,探索相关的血吸虫基因操作技术。首先,我们将外源siRNA引发的RNAi作为一种技术工具来进行日本血吸虫醛糖还原酶(SjAR)基因的功能研究。针对SjAR基因的前期基础性研究推测其可能参与了虫体的抗宿主氧化机制,同时证实了基于SjAR蛋白三维结构设计出的候选药物具有良好的杀虫效果。本研究首先设计并合成了两条针对SjAR转录本不同位置的siRNA,尝试使用电转和浸泡两种手段向感染后14天的日本血吸虫童虫中转化siRNA分子。在完成了虫体RNA抽提、反转录等步骤后,用荧光定量PCR检测SjAR基因转录本的表达水平。结果显示,浸泡法实施的RNAi成功地降低了SjAR在转录水平上的表达,siRNA处理组的SjAR转录本水平显著地低于对照组。然而,电转法实施的RNAi并未取得理想的效果,siRNA处理组与对照组的SjAR转录本水平并没有显著性差异。此后,我们使用Western杂交的方法检测了浸泡法处理对于SjAR蛋白表达水平的影响,结果显示siRNA处理组虫体的SjAR蛋白含量确实低于对照组。对SjAR基因表达水平降低的虫体进行显微观察并未发现明显的表型变化。此外,我们对血吸虫内源miRNA调控功能开展了研究。为了验证血吸虫miRNA与靶信使RNA(mRNA)的互作关系,我们开发了针对血吸虫的miRNA海绵技术平台。荧光蛋白和荧光素酶作为两种报告基因被用于了miRNA海绵转录本表达效果的验证；而电转被当做转化方法以实现外源基因在血吸虫细胞中的表达。针对GFP、Cherry两种荧光蛋白质粒DNA的电转转化操作并不能诱发明显的虫体发光现象,且虫体本身就具有的自发荧光现象影响了荧光蛋白做为报告基因在血吸虫领域的应用。然而,随后对于荧光素酶mRNA或质粒DNA的电转转化操作获得了良好的结果,虫体表达的荧光素酶能够高效地催化底物发光。不仅如此,当在荧光素酶编码序列的下游引入串联重复的血吸虫miR-71结合单位后,虫体表达的荧光素酶活力显著下降。以上结果证明了应用以荧光素酶为报告基因的miRNA海绵进行血吸虫miRNA调控功能研究的可行性。随后,我们对日本血吸虫miR-71的作用靶基因进行了预测,共得出了5个可能被miR-71调控的日本血吸虫基因。为了将来能够在蛋白水平上检测转入miR-71海绵对于靶基因表达的影响,针对这5个靶基因蛋白产物的特异性抗体是必不可少的。为此我们尝试使用大肠杆菌系统对5个靶基因进行重组表达,最终在免疫过后成功地获得了针对其中一个靶基因重组蛋白的高滴度多克隆抗体。在不久的将来,Western杂交和miRNA海绵一起能够帮助我们验证血吸虫miR-71与靶基因间的互作关系。
【关键词】：血吸虫 RNA干扰 miRNA海绵 醛糖还原酶 miR-71
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R383.24;Q78
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 第1章 序言12-20
• 一. 血吸虫病：仅次于疟疾的世界第二大寄生虫疾病12-16
• 1. 血吸虫病病原的形态特征和生活史12-13
• 2. 人类血吸虫病的主要病原种类及分布13-14
• 3. 血吸虫病的症状14-15
• 4. 三种主要人类血吸虫病病原的基因组、转录组学研究进展15-16
• 二. RNA干扰(RNAi)：双链RNA(dsRNA)引发的基因沉默现象16-17
• 三. miRNA：起源于茎环结构转录本的内源性非编码RNA17-20
• 第2章 日本血吸虫醛糖还原酶(SjAR)基因的RNA干扰20-43
• 一. 研究背景与技术路线20-24
• 1. 研究背景20-22
• 1.1 RNAi技术在血吸虫功能基因组学研究中的应用20-22
• 1.2 日本血吸虫醛糖还原酶(SjAR)的研究进展22
• 2. 技术路线22-24
• 二. 实验材料与仪器24-27
• 1. 实验材料24-25
• 1.1 培养基与电转缓冲液24
• 1.2 引物24
• 1.3 siRNAs24-25
• 1.4 实验动物25
• 1.5 血清25
• 1.6 其他试剂与耗材25
• 2. 主要实验仪器25-27
• 三. 实验方法27-34
• 1. 电转法进行SjAR基因的RNAi27-31
• 1.1 使用日本血吸虫尾蚴感染昆明鼠27
• 1.2 灌注小鼠肝门静脉进行血吸虫虫体采集27-28
• 1.3 使用电转法对感染后14天童虫进行RNAi操作28
• 1.4 血吸虫全RNA的小量提取28-29
• 1.5 血吸虫cDNA的制备29-30
• 1.6 cDNA中的基因组DNA(gDNA)污染情况检测30
• 1.7 cDNA完整性检测30
• 1.8 实时定量检测RNAi处理组与对照组SjAR基因转录水平差异30-31
• 2. 浸泡法进行SjAR基因的RNAi31-34
• 2.1 使用日本血吸虫尾蚴感染昆明鼠31
• 2.2 灌注小鼠肝门静脉进行血吸虫虫体采集31
• 2.3 使用浸泡法对感染后14天童虫进行RNAi操作31-32
• 2.4 血吸虫全RNA的小量提取32
• 2.5 从Trizol法提取血吸虫RNA的剩余样品中提取血吸虫蛋白32
• 2.6 血吸虫cDNA的制备32-33
• 2.7 实时定量检测RNAi处理组与对照组SjAR基因转录水平差异33
• 2.8 Western杂交检测RNAi处理组与对照组SjAR基因在蛋白水平上的表达差异33-34
• 四. 实验结果34-41
• 1. 电转法进行SjAR基因的RNAi34-37
• 1.1 电转法RNAi处理的分组情况和虫体RNA提取结果34
• 1.2 cDNA的完整性和gDNA污染情况检测34-35
• 1.3 荧光定量PCR检测电转法RNAi处理在SjAR基因转录水平上的效果35-37
• 1.4 小结37
• 2. 浸泡法进行SjAR基因的RNAi37-41
• 2.1 浸泡法RNAi实验的分组情况和虫体RNA提取结果37-38
• 2.2 荧光定量PCR检测浸泡法RNAi处理在SjAR基因转录水平上的效果38-39
• 2.3 Western杂交检测浸泡法RNAi处理在SjAR蛋白水平上的效果39-40
• 2.4 小结40-41
• 五. 分析与展望41-43
• 第3章 血吸虫miRNAs海绵技术的开发43-83
• 一. 研究背景与技术路线43-50
• 1. 研究背景43-48
• 1.1 血吸虫内源小型非编码RNA(sncRNA)的组学研究进展43
• 1.2 miRNA海绵技术：竞争性地抑制miRNA调控功能43-45
• 1.3 血吸虫外源基因转化、转染技术的研究进展45-48
• 2. 技术路线48-50
• 二. 实验材料与仪器50-53
• 1. 实验材料50-52
• 1.1 培养基、缓冲液与洗液50
• 1.2 引物50-51
• 1.3 质粒与菌株51
• 1.4 实验动物51
• 1.5 其他试剂与耗材51-52
• 2. 主要实验仪器52-53
• 三. 实验方法53-67
• 1. 日本血吸虫高效荧光蛋白表达质粒的构建53-56
• 1.1 原始质粒的大量制备及保种53
• 1.2 pFB-CMV-Cherry质粒的构建、保种与大量制备53-55
• 1.3 日本血吸虫高效荧光蛋白表达质粒pFB-SjAct-Cherry(GFP)的构建55-56
• 2. 荧光蛋白表达质粒的转化与虫体发光情况观察56-58
• 2.1 使用电转法向日本血吸虫童虫、成虫中转化荧光蛋白表达质粒56-57
• 2.2 荧光显微镜下观察虫体发光情况57-58
• 3. 以萤火虫荧光素酶为报告基因的血吸虫miR-71海绵表达质粒的构建58-61
• 3.1 靶向血吸虫miR-71的miRNA海绵序列设计与化学合成58
• 3.2 pGL3-Basic-Sponge质粒的构建58-60
• 3.3 pJC1-Sponge质粒的构建与大量制备60-61
• 4. 血吸虫miR-71海绵表达构件的电转化与效果评定61-67
• 4.1 曼氏血吸虫尾蚴的释放与收集61-62
• 4.2 使用双头注射器进行曼氏血吸虫尾蚴去尾转化62-64
• 4.3 miR-71海绵的体外转录64
• 4.4 使用电转法向去尾转化的童虫体内导入海绵表达构件(质粒DNA或体外转录的mRNA)64-65
• 4.5 虫体裂解液荧光素酶酶活的测定65-66
• 4.6 感染后14天日本血吸虫童虫电转转化效率的检测66-67
• 四. 实验结果67-81
• 1. 日本血吸虫高效荧光蛋白表达质粒的构建67-70
• 1.1 原始质粒的大量制备及保种67
• 1.2 pFB-CMV-Cherry质粒的构建、保种与大量制备67-68
• 1.3 SjAct基因启动子序列转录因子结合位点分析68-69
• 1.4 日本血吸虫高效荧光蛋白表达质粒pFB-SjAct-Cherry(GFP)的构建69-70
• 1.5 小结70
• 2. 荧光蛋白表达质粒的转化与虫体发光情况观察70-72
• 2.1 荧光显微镜观察结果70-72
• 2.2 小结72
• 3. 以萤火虫荧光素酶为报告基因的血吸虫miR-71海绵表达质粒的构建72-76
• 3.1 日本、曼氏血吸虫miR-71序列的查找以及miR-71海绵序列的设计与化学合成72-73
• 3.2 pGL3-Basic-Sponge质粒的构建73-74
• 3.3 pJC1-Sponge质粒的构建74-75
• 3.4 小结75-76
• 4. 血吸虫miR-71海绵表达构件的电转化与效果评定76-81
• 4.1 曼氏血吸虫尾蚴的释放、收集与去尾转化76
• 4.2 mLuc与mLuc+Sponge两种mRNA的体外转录76-77
• 4.3 海绵mRNA的电转化以及虫体匀浆荧光素酶活力测定77-78
• 4.4 海绵质粒DNA的电转化以及虫体匀浆荧光素酶活力的测定78-79
• 4.5 感染后14天的日本血吸虫电转转化效率的检测79-80
• 4.6 小结80-81
• 五. 分析与展望81-83
• 第4章 日本血吸虫miR-71的靶基因预测与批量表达83-101
• 一. 研究背景与技术路线83-85
• 1. 研究背景83-84
• 1.1 血吸虫及其它生物体中miR-71家族的研究进展83-84
• 2. 技术路线84-85
• 二. 实验材料与仪器85-88
• 1. 实验材料85-86
• 1.1 培养基85
• 1.2 引物85
• 1.3 质粒和菌株85
• 1.4 血清85-86
• 1.5 纯化介质和预装柱86
• 1.6 蛋白凝胶染色液与脱色液86
• 1.7 包涵体蛋白过柱纯化过程的相关试剂86
• 1.8 其它试剂与耗材86
• 2. 主要实验仪器86-88
• 三. 实验方法88-94
• 1. 日本血吸虫miR-71作用靶基因的预测88
• 2. 日本血吸虫miR-71作用靶基因的批量表达与纯化88-92
• 2.1 五个基因表达质粒的构建88-90
• 2.2 对表达质粒构建成功的靶基因进行小量诱导表达90
• 2.3 可诱导的蛋白的大量制备90-91
• 2.4 包涵体蛋白的变性和过柱纯化91-92
• 3. 重组蛋白兔多克隆抗体的制备及滴度评价92-94
• 3.1 兔多克隆抗体的制备92
• 3.2 间接ELISA法评价多克隆抗体滴度92-94
• 四. 实验结果94-99
• 1. 日本血吸虫miR-71作用靶基因的预测94-95
• 2. 日本血吸虫miR-71作用靶基因的批量表达与纯化95-97
• 2.1 五个基因表达质粒的构建95
• 2.2 对表达质粒构建成功的靶基因进行小量诱导表达95-96
• 2.3 可诱导的蛋白的大量制备96-97
• 2.4 包涵体蛋白的变性和过柱纯化97
• 2.5 小结97
• 3. 重组蛋白兔多克隆抗体的制备及滴度评价97-99
• 五. 分析与展望99-101
• 本研究的意义和创新点101-102
• 参考文献102-109
• 致谢109-110

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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3 MENG LingFeng;CHEN Liang;LI ZhaoYong;WU ZhengXing;SHAN Ge;;Environmental RNA interference in animals[J];Chinese Science Bulletin;2013年35期

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5 刘龙;李晓峰;马洁;秦成峰;;宿主microRNA靶向介导的减毒活疫苗研究进展[J];军事医学;2014年12期

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7 贾侃;赵r嚺

本文编号：403429