hBMP-2基因修饰的BMSCs促进BMSCs向成骨细胞分化的实验研究

发布时间：2017-05-29 03:03

  本文关键词：hBMP-2基因修饰的BMSCs促进BMSCs向成骨细胞分化的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的 1.体外分离培养及扩增纯化骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs),为骨组织工程提供种子细胞。 2.通过转基因技术,建立稳定表达骨形态发生蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2)的BMSCs细胞株。 3.检测hBMP-2基因修饰的BMSCs对BMSCs向成骨细胞分化的影响。 方法 1.取1-2个月的杂种幼犬,胫骨抽取骨髓3-4mL,全骨髓贴壁法进行分离培养及扩增纯化,观察其形态。利用成骨诱导液培养第3代的BMSCs,分别采用免疫细胞化学法、微量酶标法及茜素红染色检测骨钙素(Bone Gla Proteins, BGP)、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)的表达情况及钙结节的形成情况。利用成软骨诱导液诱导第3代BMSCs细胞团块,用HE染色及甲苯胺蓝染色检测软骨生成的情况。 2.取第3代的BMSCs,用慢病毒介导的hBMP-2基因进行转染。通过荧光显微镜观察转染后绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)表达情况,检测转染效率。通过RT-PCR和免疫细胞化学分别检测hBMP-2mRNA及其蛋白表达情况。MTT及流式细胞检测转染前后BMSCs生长增殖能力。Transwell细胞迁移实验检测慢病毒介导的hBMP-2转染对BMSCs迁移能力的影响。 3.相同实验条件下通过transwell系统共培养,对比hBMP-2转染的BMSCs与空病毒转染及未转染的BMSCs对共培养的BMSCs的促成骨分化作用,分别采用免疫细胞化学法、微量酶标法及荧光定量PCR检测BGP、ALP及Ⅰ型胶原(type Ⅰ collagen, COLL Ⅰ) mRNA的表达情况,茜素红染色检测钙结节的生成情况。 结果 1.原代BMSCs贴壁呈集落式生长,8-10天后BMSCs铺满瓶底70%-80%,传代后细胞呈长梭形,漩涡状排列,形态典型、均一,有较强的生长增殖能力。ALP检测结果显示ALP随诱导天数增加而表达增多,与对照组有显著差异(P0.05),免疫细胞化学结果显示成骨诱导后BGP呈强阳性,表达显著高于对照组(P0.05),BMSCs茜素红染色可见阳性表现的钙结节。说明分离培养的BMSCs可定向分化成成骨细胞。成软骨诱导后的BMSCs细胞团块行HE染色可观察到典型的软骨组织形态,行甲苯胺蓝染色可见软骨基质形成异染性的紫红,说明分离培养的BMSCs可定向向软骨细胞分化。 2.慢病毒介导的hBMP-2成功转染犬BMSCs,转染效率可达70%-80%；RT-PCR可检测到转染后hBMP-2mRNA的表达；免疫细胞化学可检测到转染后BMP-2蛋白的阳性表达。MTT检测生长曲线结果显示转染前后BMSCs生长增殖情况无明显改变,流式法测细胞周期结果显示转染前后细胞周期无明显改变,细胞转染后仍有较强的生长增殖能力；transwell细胞迁移实验结果显示转染后hBMP-2基因组BMSCs的迁移数量明显增多(P0.05),说明BMP-2转染可增强BMSCs的运动迁移能力。 3.共培养后hBMP-2基因转染组的BMSCs的免疫细胞化学结果BGP呈阳性,茜素红染色钙结节呈阳性,ALP表达增多,荧光定量PCR法检测Ⅰ型胶原mRNA表达水平增高,与未转染组及空载病毒组比较均有显著差异(P＜0.05),因此慢病毒介导hBMP-2基因转染BMSCs表达分泌的BMP2可诱导BMSCs向成骨细胞分化。 结论 1.全骨髓贴壁法简单、易行,可成功培养、扩增出大量纯化的犬BMSCs,能为骨组织工程提供足够的种子细胞。并且所获细胞可成功向成骨及成软骨方向诱导分化。 2.慢病毒介导的hBMP-2可成功、高效的转染犬BMSCs,并可稳定表达hBMP-2mRNA及其蛋白。 3.慢病毒介导的hBMP-2转染对细胞生长增殖无明显影响,且可增强BMSCs的迁移运动能力。 4. Transwell共培养可简单模拟体内微环境,且转基因BMSCs表达分泌的BMP2可诱导BMSCs向成骨细胞分化。
【关键词】：慢病毒载体 骨髓间充质干细胞 人骨形成蛋白2 共培养 成骨
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 英文缩略语对照5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-18
• 论文正文18-68
• 试验一：犬骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定18-35
• 1 材料及器械18-20
• 2 试验方法20-24
• 3 结果24-31
• 4 讨论31-35
• 实验二：慢病毒介导的hBMP-2基因转染对犬骨髓间充质细胞生物学性状的影响35-55
• 1 材料与器械35-37
• 2 实验方法37-43
• 3 结果43-52
• 4 讨论52-55
• 实验三：hBMP-2基因修饰的BMSCs促进BMSCs向成骨细胞分化的实验研究55-68
• 1 材料与器械56-57
• 2 实验方法57-60
• 3 结果60-65
• 4 讨论65-68
• 结论68
• 参考文献68-75
• 二、文献综述75-87
• 参考文献82-87
• 三、致谢87-88
• 四、攻读硕士学位期间所发表的论文88

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 杨宇;吴江;杨欣;孙欣;吴昊;王全颖;杨广笑;;携强绿色荧光蛋白重组慢病毒的构建及其在原代培养SD大鼠皮层神经细胞中的表达[J];吉林大学学报(医学版);2007年02期

2 张晓梅;王彬杰;王巍;王小丹;付小玻;马洪梅;张楠;;Transwell小室共培养条件下缺氧时视网膜色素上皮细胞对内皮细胞增殖的影响[J];哈尔滨医科大学学报;2011年04期

3 周诺,麦华明,梁飞新,韦山良;BMP-2、bFGF在牵引成骨中的表达及意义[J];口腔医学研究;2004年05期

4 孙钦峰;朱雪梅;杨丕山;刘玉;杜芳;;骨形成蛋白-2基因促进犬牙周组织再生的体内研究[J];上海口腔医学;2007年02期

5 战榕;吴顺泉;黄豪博;黄胜林;林君;;白血病人的gfi-1表达及慢病毒介导的gfi-1基因沉默对K562细胞增殖的影响[J];中国实验血液学杂志;2010年04期

6 罗望;张泓;许淼;顾林;孙倍成;;慢病毒——基因转移的潜在新载体[J];江苏药学与临床研究;2006年06期

7 郭英华;刘长庭;何建国;;粒细胞集落刺激因子联合携带肝细胞生长因子基因的BMSCs移植对心肌梗死大鼠血管重建的影响[J];中国修复重建外科杂志;2011年06期

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本文编号：403982