骨髓间充质干细胞对不同线性增加的流体剪应力的响应

发布时间：2017-05-29 04:10

  本文关键词：骨髓间充质干细胞对不同线性增加的流体剪应力的响应，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本研究以SD大鼠来源的骨髓间充质干细胞（BMSCs）为研究对象，通过平板流动腔装置施加流体剪应力，从细胞早期的力学敏感性响应指标，即细胞内钙离子[Ca2+]i响应水平、一氧化氮（NO）的释放量以及细胞骨架中微丝（F-actin）的重排情况来考察BMSCs对不同线性增加的流体剪应力刺激的力学敏感性响应；从细胞骨向分化标志物碱性磷酸酶（ALP）和软骨向分化标志物糖苷聚糖（GAG）的表达水平，研究不同线性增加的流体剪应力刺激对BMSC分化的影响；考察不同线性增加的流体剪应力对BMSCs的力学敏感型钙离子通道开放的贡献，以及力学敏感型钙离子通道对细胞力学敏感性的影响。 主要研究内容和结果如下： 采用全骨髓悬液直接贴壁的方法获取6周龄SD大鼠BMSCs，细胞经过传代培养扩增，用于实验的为第三、四代细胞。运用本课题组设计的平板流动腔装置分别对BMSCs施加三种不同线性增加的流体剪应力20分钟,即0分钟从0dyn/cm2线性增加到10dyn/cm2、2分钟从0dyn/cm2线性增加到10dyn/cm2、20分钟从0dyn/cm2线性增加到10dyn/cm2（分别简化为0-0’、0-2’、0-20’）。采用流体剪应力加载下实时观测细胞内钙离子响应的成像技术手段，记录BMSCs对三种加载方式的胞内钙离子响应情况；对0-0’、0-2’、0-20’三种加载方式分别作用于BMSCs20分钟后细胞中连续F-actin的密度进行定量分析；以及对三种加载方式分别作用于BMSCs1小时的过程中，系统内NO的浓度变化进行检测。结果发现，0-2’的加载方式刺激BMSCs的胞内钙离子响应水平、胞内连续F-actin聚合程度以及NO释放量最大，其次是0-0’，最后是0-20’。将细胞在0-2’、0-20’两种加载方式作用下出现第一个钙峰时对应的流体剪应力，即1dyn/cm2、0.1dyn/cm2分别作用于BMSCs20分钟并实时观测细胞内钙离子的响应情况。进行比较得到，，仍然是0-2’加载方式作用下BMSCs胞内钙离子的响应水平最大，呈现0-2’＞0-0’＞0-20’＞1dyn/cm2＞0.1dyn/cm2的现象。这意味着BMSCs能够识别不同线性增加的流体剪应力，并且对三种不同的加载方式表现出不同的力学敏感性响应，加载方式对细胞力学响应是有贡献的。 为进一步探究0-0’、0-2’、0-20’三种加载方式对BMSC分化的影响，分别对细胞进行三种方式的力学刺激20分钟后静置培养48小时，随后检测细胞中碱性磷酸酶（ALP）和糖胺聚糖（GAG）的表达。发现，0-2’加载方式后BMSCs中ALP含量最高，其次是0-20’，最后是0-0’；而GAG的结果则相反，0-0’加载方式后BMSCs的GAG含量最高，其次是0-20’，最后是0-2’。表明，0-2’加载方式有利于BMSC骨向分化，0-0’加载方式有利于BMSCs软骨向分化。 在发现以上现象的基础上，我们从细胞力学敏感型钙离子通道的角度出发，探索是否由于0-0’、0-2’、0-20’三种加载方式对BMSCs的力学敏感型钙离子通道的影响不同，进而影响了BMSCs的力学敏感性。利用力学敏感型钙离子通道阻滞剂（Gadolinium，GdCl3）对BMSCs进行预处理，同样观测了三种加载方式分别作用于BMSCs20分钟的细胞内钙离子响应水平以及20分钟后胞内连续F-actin的聚合程度，发现，0-0’加载方式下细胞的胞内钙离子响应水平和胞内连续F-actin的聚合程度最高，其次是0-2’，最后是0-20’，但是都没有显著性差异。 BMSCs受力刺激20分钟再静置培养48小时后0-2’的GAG的表达相对最高，其次是0-0’,最次是0-20’，并没有显著性差异；而0-0’的ALP的表达相对最高，其次是0-2’,最次是0-20’，彼此也没有显著性差异。表明，力学敏感型钙离子通道被阻断后，BMSCs对不同线性增加的流体剪应力不表现差异性响应。力学敏感型钙离子通道调控了BMSC对不同线性增加流体剪应力刺激的力学敏感性。 研究结果显示，BMSCs流体剪应力刺激具有高度敏感性，力学敏感型钙离子通道调控了BMSC对不同线性增加流体剪应力刺激的力学敏感性。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 流体剪应力 力学敏感型钙离子通道 细胞骨架 细胞分化
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 1 绪论9-15
• 1.1 问题的提出及研究意义9
• 1.1.1 问题的提出9
• 1.1.2 研究意义9
• 1.2 国内外研究现状9-14
• 1.2.1 BMSCs 的生物学特性9-10
• 1.2.2 诱导 BMSCs 分化的因素10-12
• 1.2.3 BMSCs 力学响应信号12-14
• 1.3 论文研究的目的与内容14-15
• 1.3.1 论文研究目的14
• 1.3.2 论文研究内容14-15
• 2 BMSCs 对不同线性增加的流体剪应力的力学敏感性响应15-32
• 2.1 引言15
• 2.2 材料和方法15-24
• 2.2.1 细胞的培养与接种15-17
• 2.2.2 流体剪应力加载和钙离子信号的实时观测17-20
• 2.2.3 细胞骨架 F-actin 的检测及其量化20-21
• 2.2.4 NO 的检测以及标准曲线的绘制21-22
• 2.2.5 总蛋白的检测以及标准曲线的绘制22-24
• 2.2.6 数据分析24
• 2.3 实验结果24-29
• 2.3.1 BMSCs 对不同线性增加的流体剪应力刺激的胞内钙离子响应24-27
• 2.3.2 BMSCs 对不同线性增加的流体剪应力刺激的 NO 浓度变化27-28
• 2.3.3 BMSCs 对不同线性增加的流体剪应力刺激后 F-actin 的变化28-29
• 2.4 讨论29-31
• 2.5 本章小结31-32
• 3 BMSCs 对不同线性增加的流体剪应力的分化表达32-39
• 3.1 引言32
• 3.2 实验材料和方法32-34
• 3.2.1 主要试剂和仪器32-33
• 3.2.2 加载实验33
• 3.2.3 碱性磷酸酶活性的测定33
• 3.2.4 糖胺聚糖的测定33-34
• 3.2.5 数据分析34
• 3.3 实验结果34-36
• 3.3.1 ALP 的结果34-35
• 3.3.2 GAG 的结果35-36
• 3.4 讨论36-38
• 3.5 本章小结38-39
• 4 力学敏感型钙离子通道对 BMSCs 力学响应的影响39-49
• 4.1 引言39
• 4.2 实验方法39-40
• 4.3 数据分析40
• 4.4 实验结果40-46
• 4.4.1 力学敏感型钙离子通道对 BMSCs 胞内钙离子响应的贡献40-43
• 4.4.2 力学敏感型钙离子通道对 BMSCs F-actin 的影响43-44
• 4.4.3 力学敏感型钙离子通道对 ALP 活性的影响44-45
• 4.4.4 力学敏感型钙离子通道对 GAG 表达的影响45-46
• 4.5 讨论46-48
• 4.6 本章小结48-49
• 5 结论与展望49-51
• 5.1 主要结论49
• 5.2 论文的不足之处与后续工作的展望49-51
• 致谢51-52
• 参考文献52-56
• 附录56

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