腺苷酸环化酶Ⅲ（AC3）在非神经细胞中定位的研究

发布时间：2017-05-31 06:08

  本文关键词：腺苷酸环化酶Ⅲ（AC3）在非神经细胞中定位的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：cAMP作为细胞内最重要的第二信使之一，调节细胞的许多生物学功能，包括卵子发生、胚胎发育、幼体发育、荷尔蒙分泌、糖代谢、平滑肌收缩、心脏收缩、嗅觉、学习以及记忆等。 腺苷酸环化酶(AC)是cAMP信号转导通路的重要组分，其主要作用是催化ATP生成cAMP。AC3是AC家族中的第3个成员，它是已分离、鉴定的其中9个膜整合蛋白之一。研究发现AC3不仅表达于小鼠海马区、下丘脑和嗅觉表皮组织等部位的神经细胞纤毛，还广泛存在于脊髓、肾上腺髓质和皮质、心房肌、主动脉平滑肌、肺、肾、胰岛、睾丸和卵巢等多种组织器官，并与多种生理功能密切相关。 纤毛是突出于真核细胞表面的、以微管为结构基础的“毛发状”细胞器，它能感知细胞外机械和化学信号刺激。纤毛分为两大类：运动纤毛和不动纤毛，不动纤毛即初级纤毛，它普遍存在于多种生物的各种类型细胞表面。初级纤毛上含有多种特异受体、离子通道蛋白和信号转导蛋白等。近年发现初级纤毛参与了细胞内信号传导等多种细胞生物学过程，对动物的发育调控及维持各个组织器官正常生理功能具有重要作用。 尽管AC3表达在多种非神经细胞中并具有重要的生理功能，但它在这些非神经细胞的表达部位，尚待确定。本研究旨在明确AC3在这些非神经细胞中的表达情况以及表达部位。 本论文以大鼠嗜铬细胞瘤PC12、人神经胶质瘤细胞U251、小鼠肾内髓集合管上皮细胞IMCD3、人肾上皮细胞293T、骨髓基质干细胞BMSCs、成骨细胞OB、人宫颈癌细胞HeLa和人肺癌细胞A549为研究材料。研究的内容主要分为2个部分： 第一部分通过RT-PCR技术对细胞的AC3基因mRNA表达水平进行半定量，PCR产物DNA测序，所得序列用生物学软件DNAMAN6．0分别将人和鼠的AC3基因cDNA进行比对分析。 第二部分：运用细胞免疫荧光染色，对PC12、U251、IMCD3、293T、OB和BMSC以及A549和HeLa细胞中AC3的表达部位进行确定。 研究结果如下： 1、以AC3基因的特异性引物，，扩增并检测AC3基因在相关细胞中有扩增产物，对PCR产物测序并进行比对分析显示，这些细胞中均有AC3基因的内源性表达。 2、免疫荧光染色结果显示PC12和U251细胞株中均发现了阳性标记的AC3抗体，并与纤毛标记抗体Acetylated α-Tubulin染色发生重叠。小鼠IMCD3细胞株和人肾组织的293T细胞中大多细胞具有初级纤毛亚结构，且AC3亚定位于该细胞的纤毛部位，在这两种肾细胞中， AC3表达于初级纤毛。BMSC细胞中能直观地观察到AC3亚定位于初级纤毛上。在A549细胞中AC3阳性结果与初级纤毛标记物Acetylated α-Tubulin阳性结果完全重合，且AC3沿着初级纤毛轴丝分布；在HeLa细胞中初级纤毛与AC3的分布情况类似于A549细胞中的结果。虽然OB细胞中也有阳性AC3呈颗粒状红色荧光，但AC3与初级纤毛并不存在共定位关系。 结论： 1、AC3基因内源性表达于PC12、U251、IMCD3、293T、BMSCs、OB、HeLa和A549细胞。 2、AC3表达于神经细胞初级纤毛，并可以作为神经细胞初级纤毛的标志物。 3、除OB细胞外，AC3也定位在检测的5种非神经细胞纤毛中。
【关键词】：酶腺苷酸环化酶Ⅲ 初级纤毛 RT-PCR 免疫荧光 定位
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416;Q78
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 中英文缩略词表11-12
• 引言12-14
• 第1章 文献综述14-27
• 1.1 腺苷酸环化酶（AC）14-16
• 1.1.1 腺苷酸环化酶（AC）简介14-15
• 1.1.2 腺苷酸环化酶Ⅲ（AC3）分布和功能15-16
• 1.2 细胞纤毛16-22
• 1.2.1 细胞纤毛的结构16-18
• 1.2.2 纤毛的功能18-20
• 1.2.3 纤毛相关疾病20-22
• 1.3 纤毛介导的 CAMP 和 Hh 信号通路22-25
• 1.3.1 cAMP 信号通路23-24
• 1.3.2 Hedgehog 信号通路24-25
• 1.4 立项依据25-27
• 第2章 RT-PCR 检测 AC3 在各种细胞中的表达情况27-43
• 2.1 实验材料27-31
• 2.1.1 仪器27
• 2.1.2 试剂和溶液27-30
• 2.1.3 细胞类型30-31
• 2.1.4 耗材31
• 2.2 方法31-38
• 2.2.1 原代骨髓基质干细胞分离培养31-32
• 2.2.2 成骨细胞的原代分离培养32
• 2.2.3 细胞系传代32-33
• 2.2.4 细胞的冻存与复苏33-34
• 2.2.5 总 RNA 提取34
• 2.2.6 反转录34-36
• 2.2.7 RT-PCR36-37
• 2.2.8 核苷酸序列分析37-38
• 2.3 结果38-41
• 2.3.1 明场下观察骨髓间充质干细胞生长状态38
• 2.3.2 明场下观察成骨细胞形态38
• 2.3.3 总 RNA 提取38-39
• 2.3.4 AC3 基因在多种类型细胞中表达39-41
• 2.4 讨论41-43
• 第3章 腺苷酸环化酶Ⅲ(AC3)在多种细胞中的定位43-55
• 3.1 实验材料43-44
• 3.1.1 仪器43
• 3.1.2 试剂43
• 3.1.3 溶液43-44
• 3.2 实验方法44-45
• 3.2.1 纤毛诱导及免疫荧光染色44-45
• 3.3 实验结果45-52
• 3.3.1 AC3 在神经细胞初级纤毛的定位45-46
• 3.3.2 AC3 在非神经细胞初级纤毛的表达46-50
• 3.3.3 AC3 在癌细胞初级纤毛中的定位50-52
• 3.4 讨论52-55
• 结论55-56
• 参考文献56-67
• 致谢67-68
• 读研期间发表的论文68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 张海龙;黄朝梁;;骨保护素的研究进展[J];中华医学杂志;2006年31期

2 ;SPARCL1, Shp2, MSH2, E-cadherin, p53, ADCY-2 and MAPK are prognosis-related in colorectal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2011年15期

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本文编号：408780