AAPH诱导氧化应激对胚胎成骨的影响

发布时间：2017-05-31 20:23

  本文关键词：AAPH诱导氧化应激对胚胎成骨的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究已证明氧化应激与胚胎发育不良有着密切联系,骨骼系统的发育是胚胎发育的一个重要环节,然而关于氧化应激与胚胎骨骼发育的关系研究还报道尚少。在前期研究中我们发现高剂量自由基诱导剂诱导的氧化应激会导致胚胎肢芽发育畸形,本文将进一步深入探讨氧化应激对胚胎骨生成的影响与作用机制。首先,我们给予鸡胚不同浓度的AAPH(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μmol/egg)建立氧化应激鸡胚模型。给予AAPH处理后,鸡胚孵育至12.5天,测定相关指标,确定建立慢性氧化应激鸡胚模型的最佳剂量。结果显示,鸡胚的死亡率和畸形率随着AAPH浓度的增加而增加,AAPH对鸡胚的半数致死剂量为4.8μmol/egg。不同浓度的AAPH(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μmol/egg)均能造成鸡胚氧化应激,例如骨骺软骨细胞ROS生成速率增高,线粒体膜电位降低。我们确定0.5μmol/egg的AAPH作为建立慢性氧化应激鸡胚模型的剂量,在此剂量下鸡胚长骨长度较正常组相比显著性缩短。其次,我们以AAPH(0.5μmol/egg)建立的氧化应激鸡胚模型为基础,探讨氧化应激对胚胎软骨内成骨的影响,为此依次进行了以下实验:(1)连续取16.5、17.5、18.5天鸡胚长骨进行阿利新蓝茜素红双染,测量胫骨和股骨长度,检测氧化应激对鸡胚长骨生长速度的影响。结果显示,AAPH诱导的氧化应激能显著性减缓鸡胚长骨的生长速度,缩短长骨长度。(2)连续取16.5、17.5、18.5天鸡胚长骨进行石蜡切片,HE染色处理,分别测量其胫骨、股骨骨骺端软骨细胞增殖区和软骨细胞膨大区的长度,检测氧化应激对鸡胚长骨软骨内成骨的两个关键步骤—软骨细胞增殖和软骨细胞膨大的影响。结果显示,氧化应激显著性缩短了鸡胚长骨骨骺端软骨细胞增殖区和膨大区的长度,导致鸡胚长骨软骨细胞增殖速度减慢,软骨细胞膨大骨化速度降低。同时还发现鸡胚长骨骨骺软骨增殖区软骨细胞总数减少,正处于分裂期的细胞数下降。(3)采用Micro-CT术检测鸡胚发育后期长骨的相关骨指标,验证氧化应激导致的胚胎骨发育不良。结果显示,氧化应激显著性降低了鸡胚长骨的骨量和骨密度,导致胚胎不良的骨生成。(4)采用RT-PCR术检测软骨内成骨的关键调控因子Sox9和Runx2以及相关基因Type II collagen和Aggrecan的基因表达。结果显示,氧化应激显著性降低了这些基因的表达水平。综上所述,AAPH(0.5μmol/egg)诱导的慢性氧化应激会导致胚胎长骨Sox9的表达下降,从而下调了Type II collagen和Aggrecan的表达,影响了软骨细胞的生存、营养和代谢,抑制了软骨细胞的增殖,减缓了长骨的生长发育速度。AAPH氧化应激诱导的Sox9蛋白量表达下降,会直接导致预膨大软骨细胞中磷酸化Sox9蛋白的减少,导致预膨大软骨细胞直接进入终末分化阶段,发生凋亡,大大减少了成熟膨大软骨细胞的数量,造成Runx2表达的降低,导致长骨的骨化不良、骨量和骨密度降低。本研究结果阐明了氧化应激对胚胎骨生成的影响,并初步揭示了具有临床代表性的胚胎慢性氧化应激对骨骼发育的影响机制,该研究结果对预防和治疗氧化应激对胚胎发育的影响、提高胚胎发育质量有着重要意义。
【关键词】：鸡胚模型 胚胎骨生成 氧化应激 活性氧自由基 软骨内成骨
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R321
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文缩略词表7-11
• 第一章 前言11-21
• 1 氧化应激与生物体的抗氧化系统11-12
• 1.1 氧化应激11
• 1.2 活性氧自由基与抗氧化酶11-12
• 2 氧化应激与胚胎发育12-16
• 2.1 胚胎发育14
• 2.2 骨骼发育14-16
• 3 成骨细胞系16-17
• 3.1 成骨细胞的特征16
• 3.2 成骨细胞系的分化16-17
• 4 胚胎期和胚胎出生后的骨骼发育17-19
• 4.1 调控因子17-19
• 5 鸡胚模型的应用性19
• 6 自由基诱导剂AAPH19
• 7 立题依据19-21
• 第二章 AAPH诱导胚胎慢性氧化应激模型21-31
• 1 材料与方法21-25
• 1.1 实验材料21-23
• 1.2 实验分组23-24
• 1.3 阿利新兰&茜素红双染检测胚胎整体骨骼系统发育情况24
• 1.4 DCFH-DA荧光探针法检测骨骺软骨细胞的活性氧自由基生成速率24-25
• 1.5 流式细胞术检测骨骺软骨细胞的线粒体膜电位25
• 1.6 数据统计与分析25
• 2 实验结果25-29
• 2.1 不同浓度AAPH组的胚胎死亡率和畸形率25-26
• 2.2 通过阿利新兰&茜素红双染检测胚胎整体骨骼系统发育情况26-28
• 2.3 不同浓度AAPH对胚胎骨骺软骨细胞活性氧自由基生成速率的影响28
• 2.4 不同浓度的AAPH对骨骺软骨细胞线粒体膜电位的影响28-29
• 3 小结与讨论29-31
• 第三章 活性氧自由基对软骨内成骨软骨细胞增殖的影响31-47
• 1 材料与方法32-37
• 1.1 实验材料32-34
• 1.2 16.5、17.5、18.5 天胚胎长骨阿利新兰&茜素红染色34
• 1.3 16.5、17.5、18.5 天胚胎长骨H&E染色34-35
• 1.4 16.5、17.5、18.5 天胚胎长骨阿利新兰&伊红染色35
• 1.5 RT-PCR检测胚胎长骨基因表达35-37
• 1.6 数据统计与分析37
• 2 实验结果37-45
• 2.1 AAPH对 16.5、17.5、18.5 天鸡胚股骨和胫骨长度变化的影响37-39
• 2.2 AAPH对 16.5、17.5、18.5 天鸡胚股骨和胫骨软骨增殖区长度变化的影响39-41
• 2.3 AAPH对软骨增殖区软骨细胞总数和处于分裂期的细胞数的影响41-43
• 2.4 AAPH对胚胎长骨基因表达的影响43-45
• 3 小结与讨论45-47
• 第四章 活性氧自由基对软骨内成骨软骨细胞膨大的影响47-60
• 1 材料与方法48-52
• 1.1 实验材料48-50
• 1.2 16.5、17.5、18.5 天胚胎长骨H&E染色50
• 1.3 DAPI染料检测膨大软骨细胞凋亡50-51
• 1.4 RT-PCR检测胚胎长骨基因表达51-52
• 1.5 微电脑x射线断层扫描（Micro-CT）分析52
• 1.6 数据统计与分析52
• 2 实验结果52-58
• 2.1 AAPH对 16.5、17.5、18.5 天鸡胚股骨和胫骨软骨膨大区长度变化的影响52-55
• 2.2 AAPH对鸡胚长骨骨骺膨大软骨细胞的凋亡与终末分化的影响55
• 2.3 AAPH对胚胎长骨基因表达的影响55-56
• 2.4 AAPH对 18.5 天鸡胚股骨和胫骨骨化的影响56-58
• 3 小结与讨论58-60
• 结论与展望60-62
• 结论60-61
• 创新和突破61
• 展望61-62
• 参考文献62-70
• 致谢70

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李青春;李岱;;白藜芦醇对眼部疾病防治机制的研究进展[J];实用医学杂志;2014年24期

  本文关键词：AAPH诱导氧化应激对胚胎成骨的影响，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：410578