B群脑膜炎奈瑟菌NspA核酸疫苗的免疫活性及保护作用的初步研究

发布时间：2017-05-31 21:05

  本文关键词：B群脑膜炎奈瑟菌NspA核酸疫苗的免疫活性及保护作用的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：扩增B群脑膜炎奈瑟菌表面蛋白A（NspA）基因，构建pcDNA3.1(+)/NspA真核重组载体，通过肌注和滴鼻法免疫雌性BALB/c小鼠，观察小鼠体内产生体液免疫和细胞免疫应答水平，计算疫苗的免疫保护率，为研究B群脑膜炎奈瑟菌核酸疫苗提供相关的实验依据。 方法：制备去内毒素的pcDNA3.1(+)/NspA真核重组载体，通过Lip2000转染试剂在RAW264.7和COS-7细胞中进行转染，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测nspa基因mRNA的转录水平，通过免疫组化法检测NspA基因在真核细胞中的表达水平。通过肌注和滴鼻的方式免疫3-4周龄的雌性BALB/c小鼠，采用间接ELISA法检测小鼠血清中产生的特异性IgG和生殖道黏膜灌洗液中sIgA抗体水平， ELISA双抗体夹心法检测免疫小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ、IL-4的水平，CCK8法检测脾淋巴细胞增殖反应。构建脑膜炎球菌动物感染模型，观察核酸疫苗对实验小鼠的免疫保护率。 结果： （1）构建的pcDNA3.1(+)/NspA真核重组载体经公司测序及酶切鉴定结果正确。 （2） pcDNA3.1(+)/NspA真核重组载体能有效地在真核细胞中进行转录和表达。 (3)核酸疫苗通过滴鼻和肌注法免疫小鼠后，能够刺激小鼠体内产生特异性抗NspA的抗体，并且抗体水平随免疫时间递增呈上升趋势： ①在免疫后第6周，滴鼻法的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组的小鼠生殖道灌洗液中特异性sIgA水平明显高于pcDNA3.1(+)和PBS组（P0.01），pcDNA3.1(+)/NspA+CpG与pcDNA3.1(+)/NspA相比较无显著性差异（P0.05），pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组抗体效价为1:3000；肌注法的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组的小鼠生殖道灌洗液中特异性sIgA水平明显高于pcDNA3.1(+)和PBS组（P0.01），而pcDNA3.1(+)/NspA+CpG与pcDNA3.1(+)/NspA相比较无显著性差异（P0.05），pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组抗体效价为1:1875； ②在免疫后第6周，滴鼻法的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组的小鼠血清中特异性IgG水平明显高于pcDNA3.1(+)和PBS组（P0.01），而pcDNA3.1(+)/NspA+CpG与pcDNA3.1(+)/NspA相比较无显著性差异（P0.05），pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组抗体效价为1:3750；肌注法的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组的小鼠血清中特异性IgG水平明显高于pcDNA3.1(+)和PBS组（P0.01），而pcDNA3.1(+)/NspA+CpG与pcDNA3.1(+)/NspA相比较无显著性差异（P0.05），pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组抗体效价为1:5000； ③经滴鼻和肌注免疫的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组小鼠脾淋巴细胞上清液中的IL-4、IFN-γ含量明显高于pcDNA3.1(+)和PBS组（P0.01），而pcDNA3.1(+)/NspA+CpG与pcDNA3.1(+)/NspA相比较无显著性差异（P0.05）； ④肌注法的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组的脾淋巴细胞刺激指数（SI，1.45±0.03）显著高于、PBS（0.30±0.01）与pcDNA3.1（+）组（0.44±0.02），，（P0.05）；滴鼻法pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组的S（I1.55±0.06）明显高于PBS（0.34±0.05）与pcDNA3.1（+）组（0.51±0.04），（P0.05）；而肌注法、滴鼻法的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG与pcDNA3.1(+)/NspA组相比较无显著性差异（P0.05）； (4)核酸疫苗的免疫保护效果：①肌注法： pcDNA3.1(+)/NspA+CpG、pcDNA3.1(+)/NspA组在72h内的存活率分别为90%、80%；pcDNA3.1(+)组和PBS组24h内的存活率分别为30%和20%，48h内的存活率均为0；②滴鼻法：pcDNA3.1(+)/NspA+CpG、pcDNA3.1(+)/NspA组在72h内的存活率分别为80%、70%，pcDNA3.1(+)组和PBS组24h内的存活率分别为30%和20%，48h内的存活率均为0。 结论： （1）核酸疫苗pcDNA3.1(+)/NspA可诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫和细胞免疫应答； （2）核酸疫苗对B群脑膜炎球菌感染的实验小鼠具有一定的免疫保护作用，肌注途径的免疫保护作用优于滴鼻途径； （3）佐剂CpG对NspA核酸疫苗的免疫活性和保护效果的增强作用不明显。
【关键词】：B群脑膜炎奈瑟菌 奈瑟菌表面蛋白A（NspA） 核酸疫苗 免疫活性 免疫保护
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 常用英文缩写4-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-14
• 实验材料14-16
• 实验方法16-28
• 实验结果28-41
• 讨论41-44
• 结论44-45
• 参考文献45-48
• 附录48-52
• 文献综述52-61
• 参考文献58-61
• 研究成果及发表论文61-62
• 致谢62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

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  本文关键词：B群脑膜炎奈瑟菌NspA核酸疫苗的免疫活性及保护作用的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：410620