钙离子结合蛋白S100A4的原核表达纯化以及S100A6单克隆抗体的制备

发布时间：2017-06-01 00:15

  本文关键词：钙离子结合蛋白S100A4的原核表达纯化以及S100A6单克隆抗体的制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肝脏是人体最大的消化器官，主要负责维持新陈代谢的正常进行。由于肝脏参与食物消化这一特殊功能，使其极易发生病变，引起包括急性肝衰和肝脏纤维化等发病率和死亡率都较高的疾病的发生，从而引起人们的重视。 通过CCl4诱导的小鼠急慢性肝损伤模型和基因芯片等技术手段，我们深入探讨了肝脏损伤修复的原理和机制，从而获得治疗肝损伤的全新思路和药物靶点。其中S100家族随着肝脏损伤修复过程呈现的规律性的表达变化，使其成为我们的重点研究对象。 本论文以S100家族为切入点，主要包括两部分的研究内容：重组人S100A4的原核表达纯化及活性测定和S100A6单克隆抗体的制备。 S100A4是S100蛋白家族的成员，在细胞的增殖，分化，损伤修复以及肿瘤细胞转移等方面发挥重要的调控作用。本研究将S100A4全长基因构建到pET28a原核表达载体上，利用大肠杆菌表达系统表达和纯化出高纯度的重组人S100A4。通过试验证明，重组人S100A4蛋白在体外可以有效的增强黑色素瘤细胞A375-S2的增殖。重组人S100A4原核表达与纯化方法的建立将促进其结构和生物学功能研究，并且对于S100蛋白家族其他蛋白的表达与纯化具有重要的参考意义。并且可用于后期对肝脏纤维化模型的药效和药理研究。 为了制备抗人S100A6的单克隆抗体，利用原核表达纯化后所得纯度97%的hS100A6为抗原，与弗氏佐剂相结合免疫Balb/c小鼠。利用杂交瘤技术，处死免疫小鼠，取脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合，利用HAT选择性培养基筛选杂交瘤。采用Elisa检测，并用有限稀释法筛选出分泌特异抗人S100A6抗体的杂交瘤细胞株。腹腔注射同种小鼠诱导腹水产生,并应用Protein G亲和层析法进行抗体纯化。采用单克隆抗体可变区VH和VL基因组测序，为抗体可变区分区；通过Elisa、WesternBlot鉴定该单克隆抗体。结果获得2株可稳定分泌小鼠抗人S100A6的单克隆抗体，分别命名为5-1G，8-6G。Elisa和Western Blot分析表明该2株单抗均能特异性识别hS100A6。最终成功制备了2株鼠抗人S100A6蛋白的单克隆抗体，，为建立S100A6蛋白检测奠定了基础。并且可用于后续S100A6中和抗体调节肝脏纤维化的药理学研究。
【关键词】：肝纤维化 S100家族 S100A4 原核表达纯化 单克隆抗体
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 目录10-12
• 缩略词中英文对照12-13
• 第一章 绪论13-22
• 1 肝脏病变的研究现状13-15
• 1.1 急性肝衰竭13-14
• 1.2 肝脏纤维化14-15
• 2 钙离子结合蛋白 S100 家族研究进展15-17
• 2.1 S100A4 研究现状15-16
• 2.2 S100A6 研究现状16-17
• 3 基因芯片在肝脏损伤模型上的应用17-20
• 3.1 四氯化碳诱导急性肝损伤模型基因芯片结果18-19
• 3.2 四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型基因芯片结果19-20
• 4 立题依据和研究内容20-22
• 4.1 立题依据20-21
• 4.2 研究内容21-22
• 第二章 重组人 S100A4 蛋白的表达与纯化22-55
• 1 引言22-23
• 2 材料与方法23-43
• 2.1 仪器与设备23-25
• 2.2 实验材料和试剂25-26
• 2.3 常用溶液的配制26-29
• 2.4 实验方法29-36
• 2.5 重组 S100A4 的表达和纯化36-40
• 2.6 SDS-PAGE 和 Western blot 检测40-41
• 2.7 S100A4 内毒素含量测定41
• 2.8 Bradford 法测 S100A4 蛋白溶液浓度41-42
• 2.9 S100A4 蛋白活性的测定42-43
• 3 实验结果43-52
• 3.1 重组人 S100A4 原核表达质粒的构建43-47
• 3.2 rhS100A4 重组蛋白的原核表达和纯化47-51
• 3.3 rhS100A4 重组蛋白的质量检测51-52
• 4 讨论52-55
• 第三章 S100A6 单克隆抗体的制备55-92
• 1 引言55-57
• 2 材料与方法57-77
• 2.1 仪器与设备57-58
• 2.2 实验材料和试剂58-59
• 2.3 主要溶液配制59-63
• 2.4 hS100A6 免疫 Balb/c 小鼠63-65
• 2.5 PEG 介导的小鼠脾脏和小鼠骨髓瘤细胞融合与杂交瘤筛选65-68
• 2.6 有限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞68
• 2.7 Anti-hS100A6 单链抗体的构建68-74
• 2.8 杂交瘤细胞产生同种小鼠腹水的制备74-75
• 2.9 Hi Trap Protein G 预装柱纯化腹水中 S100A6 单抗75-77
• 3 实验结果77-88
• 3.1 hS100A6 免疫 Balb/c 小鼠77-78
• 3.2 抗原最佳包被量的检测78-79
• 3.3 有限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株79-82
• 3.4 抗体可变区的测序82-85
• 3.5 Anti-rhS100A6 抗体纯化以及检测85-88
• 4 讨论88-92
• 第四章 结论和展望92-94
• 1. 结论92
• 2. 展望92-94
• 参考文献94-101
• 附录101-104
• 致谢104-106
• 攻读硕士学位期间发表的论文106

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