中华按蚊kdr基因突变检测方法的建立及应用

发布时间：2017-06-02 00:00

  本文关键词：中华按蚊kdr基因突变检测方法的建立及应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：中华按蚊（Anopheles sinensis）在我国分布广泛，是间日疟和马来丝虫病传播的重要媒介。以往的研究发现中华按蚊具有家、野两栖且偏嗜吸动物血的习性，其疟疾传播能量较弱。然而最近相关的文献报道显示我国中部地区的中华按蚊疟疾传播能量较上世纪有明显提升。作为我国中部地区目前最主要的疟疾传播媒介，中华按蚊在当地疟疾控制中的重要性日益受到重视。 媒介防制是疟疾控制阶段和消除阶段的关键措施之一。在我国疟疾控制阶段，主要的媒介防制措施是在疟疾流行区大范围采用杀虫剂室内滞留喷洒或药物浸泡蚊帐为主的成蚊防制方法。随着杀虫剂的广泛应用，昆虫对杀虫剂的抗性迅速在全球范围内扩散。昆虫对杀虫剂抗性的机制一直是人们关注的重要问题，越来越多的研究集中于对杀虫剂抗性机理的研究，昆虫对杀虫剂的抗性机制主要有四种：靶标抗性、代谢抗性、行为抗性和表皮化抗性，其中靶标抗性和代谢抗性在昆虫抗药性的形成中起着重要作用，即：昆虫神经系统对杀虫剂靶位点敏感性的改变和解毒酶表达水平或活性的改变。击倒抗性（knockdown resistance, kdr）是靶标抗性中的重要代表。一系列的相关研究发现拟除虫菊酯类杀虫剂的主要作用机理是通过钠离子通道（voltage gated sodium channel, VGSC）的持续活化使昆虫经由兴奋、痉挛到麻痹而导致昆虫死亡。钠离子通道蛋白第二结构域S6区段编码的氨基酸序列的改变，即kdr基因L1014位点突变，是引起昆虫对杀虫剂抗药性的关键。 自Kdr基因L1014位点的突变在家蝇、蟑螂等昆虫中发现后，又相继在冈比亚按蚊、库蚊中发现其kdr基因L1014位点存在类似的突变。2007年，Kim H等报道鉴定了中华按蚊kdr基因存在L1014F和L1014C突变类型，kdr基因突变后的中华按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感性下降，2011年武松等报道了我国中华按蚊kdr基因也存在L1014F和L1014C突变。 在我国进入疟疾消除阶段后，主要的媒介防制措施是对出现疟疾病例疫点采用杀虫剂室内滞留喷洒方法来阻断可能的疟疾传播。目前在疫点媒介防制中应用最为广泛的杀虫剂仍是拟除虫菊酯类杀虫剂。而在媒介防制措施中选择有效的杀虫剂依赖于对媒介生物抗药性水平的了解，因此不同地区的蚊虫击倒抗性相关基因频率可以为媒介防止措施提供重要的科学依据。关于检测kdr突变的方法较多，等位基因特异性PCR（AS-PCR）是最早建立的kdr突变检测方法，该方法具有简单易于操作的优点，但敏感性和特异性较低；SSOP-ELISA、HOLA和PCR-Dot等方法与AS-PCR相比在敏感性和特异性上有一定的提高，但操作步骤繁琐，耗时长达5～18小时，因此难以在现场媒介监测中推广应用。近年来发展起来的HRM、FRET/MCA、PCR elongation荧光法等也因仪器设备昂贵或操作繁琐等原因受到限制。2012年Athanase等报道了AS-LAMP用于检测冈比亚按蚊kdr的突变，虽然简单方便省时，但引物设计困难，而且敏感性和特异性也不尽如人意。上述这些方法主要用于其他蚊种的kdr突变检测，目前报道的中华按蚊kdr突变检测方法仅有AS-PCR和rtPASA法，而这两种方法敏感性和特异性均存在不足，容易漏检错检。 为解决上述问题，本研究拟根据中华按蚊kdr基因L1014F和L1014C两种常见突变型，建立了2种新的可用于中华按蚊kdr基因L1014位点突变检测的实时荧光定量PCR方法，并与经典的kdr基因突变检测方法AS-PCR进行比较，还通过对现场中华按蚊样本的检测评估其现场应用价值。研究包括四部分： 第一部分 TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测中华按蚊kdr基因突变的研究 方法：根据文献报道的中华按蚊钠离子通道蛋白（VGSC）基因序列（Genbank登录号：GI84646709）及其L1014位点的常见突变类型，设计一对实时荧光定量PCR扩增引物和三条TaqMan-MGB探针。用Fast Tissue-to-PCR Kit试剂盒提取的中华按蚊江苏实验株样本gDNA为模板，对反应体系中的引物浓度、探针浓度、DNA模板量和反应条件进行优化。 结果：采用根据中华按蚊钠离子通道（VGSC）基因序列及其L1014位点突变类型设计的一对引物和三条TaqMan-MGB探针进行实时荧光定量PCR扩增，经优化后的反应体系为：总反应体系10μL，其中Thermo Scientific Maxima ProbeqPCR Master Mix（2×）5μL，引物浓度500nmol/L，TaqMan-MGB探针浓度500nmol/L，模板2μL。反应条件采用两步法，即：50℃2min，95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环；40℃冷却10s；用优化后的反应体系和反应条件对突变型和野生型进行单管三重探针检测，检测结果与测序完全一致，但仅能区分是否发生突变，不能鉴别具体的突变类型；对六种不同的kdr基因型进行双管两重探针检测，可对具体的突变类型进行鉴别，检测结果与测序结果也完全符合。 第二部分 Allglo探针实时荧光定量PCR检测中华按蚊kdr基因的研究 方法：根据文献报道的中华按蚊钠离子通道蛋白（VGSC）基因序列（Genbank登录号：GI84646709）及其L1014位点的常见突变类型，设计一对实时荧光定量PCR扩增引物和三条Allglo探针。用Fast Tissue-to-PCR Kit试剂盒提取的中华按蚊江苏实验株样本gDNA为模板，对引物浓度、探针浓度、DNA模板量和退火温度等进行优化。 结果：采用根据中华按蚊钠离子通道（VGSC）基因序列及其L1014位点突变类型设计的一对引物和三条Allglo探针进行实时荧光定量PCR扩增，经优化后的反应体系为：总反应体系10μL，其中HR qPCR Probes Master（2×）5μL，引物浓度600nmol/L，Allglo探针浓度600nmol/L，模板2μL。反应条件采用两步法，即：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环；40℃冷却10s。用优化后的反应体系和反应条件采用单管三重探针法可以对六种不同的kdr基因型进行鉴别，不需要进一步进行双管两重探针检测，检测结果与测序结果完全符合。 第三部分 三种中华按蚊kdr基因突变检测技术的比较 方法：用前述建立的TaqMan-MGB探针法和Allglo探针法，与D. Zhong等报道的AS-PCR检测方法，对163个经测序证实的中华按蚊样本和重组质粒标准kdr基因DNA模板进行kdr基因L1014位点突变检测，评估三种方法的准确性、敏感性，并就成本、耗时等方面进行综合比较。 结果：同“金标准”DNA测序相比较，，Allglo探针的准确率最高，错判和误判最少，TaqMan-MGB的准确率次之，略低于Allglo探针；AS-PCR的准确率为三者中最差。敏感性的比较结果显示TaqMan-MGB探针和Allglo探针均具有比较高的敏感性且两种方法的敏感性比较接近，AS-PCR的敏感性相对较低。结合成本和耗时因素分析，“金标准”DNA测序的成本最高，TaqMan-MGB探针检测法次之，Allglo探针检测的成本较测序和TaqMan-MGB法有降低，AS-PCR的成本最低，但其准确率也最差。综合比较分析发现，Allglo探针法不仅检测准确率较高，而且成本低、耗时短，因此更适用于现场中华按蚊kdr基因L1014位点突变的检测。 第四部分 Allglo探针法用于现场中华按蚊kdr基因L1014位点突变的检测 方法：利用前述已经建立的Allglo探针实时荧光定量PCR对从我国中部不同省份不同地点采集的中华按蚊样本进行kdr基因检测。并对中华按蚊kdr基因的突变频率与文献报道的采集地中华按蚊抗性水平进行初步的比较分析。 结果：根据不同省份的中华按蚊kdr基因L1014位点突变的检测结果，发现河南、山东、浙江和江苏等省的中华按蚊kdr基因L1014位点均存在很高的突变频率。其中河南省的中华按蚊样本kdr基因突变频率为90.48%，浙江省的中华按蚊样本kdr基因突变频率为97.71%，山东省的中华按蚊样本kdr基因突变频率为90.63%，江苏省的中华按蚊样本kdr基因突变频率为87.61%。只有湖北省的中华按蚊样本kdr基因突变频率较低为45.38%。这些省份的中华按蚊kdr基因较高的突变率可能与该地区中华按蚊较高的抗药性有关。
【关键词】：中华按蚊 拟除虫菊酯 击倒抗性 突变 荧光定量PCR
【学位授予单位】：江苏省血吸虫病防治研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R384.1
【目录】：

• 摘要6-10
• Abstract10-15
• 序言15-19
• 第一部分 TaqMan-MGB 探针实时荧光定量 PCR 检测中华按蚊 kdr基因突变的研究19-35
• 第二部分 Allglo 探针实时荧光定量 PCR 检测中华按蚊 kdr 基因的研究35-48
• 第三部分 三种中华按蚊 kdr 基因突变检测技术的比较48-71
• 第四部分 Allglo 探针法用于现场中华按蚊 kdr 基因 L1014 位点突变的检测71-77
• 结论77-78
• 参考文献78-84
• 致谢84-85
• 综述85-98
• 参考文献93-98
• 附录98-99
• 研究生在读期间发表论文99

【参考文献】

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本文编号：413743