IL-6受体融合蛋白的表达及初步鉴定

发布时间：2017-06-02 07:12

  本文关键词：IL-6受体融合蛋白的表达及初步鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的白细胞介素6(Interleukin-6，IL-6)由多种细胞如单核细胞，成纤维细胞，内皮细胞，肝细胞，淋巴细胞，肿瘤细胞产生的多功能细胞因子，可以参与机体多种反应，比如刺激多种细胞增殖分化，骨髓造血，自身免疫和机体防御等。IL-6在哮喘、多发性硬化、慢性类风湿性关节炎，炎症性肠炎等多种免疫性疾病中水平异常增高，且阻断IL-6后疾病严重程度减轻。本课题根据鼠IL-6受体结构特点构建表达出可以阻断IL-6信号通路的鼠IL-6受体融合蛋白（mouse IL-6receptorfusion protein，mIL-6-RFP），为后期研究IL-6在炎症性疾病模型中的作用奠定了基础。 方法首先设计引物，以mIL-6-RFP-pcDNA3.1质粒为模板扩增出目的基因mIL-6-RFP。随后将mIL-6-RFP与高效克隆PCR产物的专用载体pMD18-T连接后转化XL1-BLue。扩大培养后提取质粒为mIL-6-RFP-pMD18-T，将mIL-6-RFP-pMD18-T与杆状病毒表达系统转移载体pFastBacHTA酶切后连接，而后将连接产物转化DH5α。扩大培养后提取质粒为mIL-6-RFP-pFastBacHTA，经测序鉴定正确后转化含有Bacmid载体的大肠杆菌DH10Bac，在DH10Bac菌体内，mIL-6-RFP-pFastBacHTA上的mIL-6-RFP转座到Bacmid的乳糖操纵子盒式结构中得到重组Bacmid。重组Bacmid通过连续两次抗生素加蓝白斑筛选获得阳性单克隆，扩大培养后用大型质粒提取试剂盒提取重组Bacmid。采用PCR方法鉴定重组Bacmid，引物为pUC/M13。鉴定结果正确后，利用脂质体Cellfectin介导重组Bacmid转染Sf9细胞，并通过观察细胞病变确定转染是否成功。当转染成功后收集细胞上清为具有感染性的第一代重组病毒粒子。随后用第一代重组病毒粒子感染Sf9收集上清为第二代病毒，同时收集细胞提取细胞内总蛋白经Western Blot鉴定目的蛋白是否表达。而后用第二代病毒感染Sf9获得第三代病毒。采用空斑试验检测第三代病毒的滴度。蛋白表达前，在24孔板上摸索蛋白表达的优化条件，同时将单层培养的细胞驯化为悬浮旋转培养。当悬浮培养达到600ml后用第三代病毒感染Sf9。收集细胞及培养基进行蛋白纯化获得大量目的蛋白mIL-6-RFP。 结果经过基因重组技术成功将目的基因插入转移载体pFastBacHTA得到重组pFastBacHTA，命名为mIL-6RFP-pFastBacHTA，重组质粒经测序鉴定正确后成功转化DH10Bac细菌，挑选经抗生素及蓝白斑两次筛选成功获得出的白色阳性单克隆，扩大培养后用大型质粒提取试剂盒成功提取出重组Bacmid，经PCR鉴定后约在4500bp处左右出现目的条带。重组Bacmid转染昆虫细胞Sf9，转染后第五天出现细胞病变说明转染成功，Western Blot鉴定显示感染组细胞在94kd处有特异蛋白的表达，而正常组则没有，与预期结果一致，进一步证明转染成功。收集转染后的细胞上清获得第一代重组病毒粒子，并成功扩增病毒至第三代重组病毒粒子，通过空斑实验计算出第三代病毒滴度为4×107PFU/ml。蛋白表达条件优化在24孔板上进行，得到优化条件为感染复数MOI=8，接种72h后收集蛋白。单层静止培养的Sf9细胞成功驯化为悬浮旋转培养，适用于后期蛋白表达。第三代重组病毒粒子感染复数MOI=8感染600ml悬浮旋转培养昆虫细胞Sf9，病毒接种后72h收集蛋白，成功收获全部培养上清及细胞。采用蛋白纯化仪器AKTApurifier UPC10纯化培养上清及细胞内的蛋白，培养上清中蛋白纯化条件：10mM，20mM咪唑洗涤，200mM洗脱；细胞内蛋白纯化条件：2.5mM，5mM咪唑洗涤，200mM洗脱。大量蛋白纯化后获得蛋白浓度为：培养上清中蛋白样品浓度约0.15μg/μl，约1.5ml，细胞内蛋白样品浓度约0.35μg/μl,约2ml。 结论成功获得大量的重组杆状病毒以及大量的蛋白，为后续实验奠定了坚实的基础。
【关键词】：IL-6受体 杆状病毒表达系统 蛋白纯化
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 中英文缩略词对照表5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-14
• 材料与方法14-34
• 结果34-37
• 讨论37-40
• 结论40
• 参考文献40-43
• 附录一 部分试剂配方43-47
• 附录二 个人简历47-49
• 附录三 致谢49-50
• 附录四 综述50-60
• 文献56-60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Lydia Giannitrapani;Maurizio Soresi;Daniele Balasus;Anna Licata;Giuseppe Montalto;;Genetic association of interleukin-6 polymorphism (-174 G/C) with chronic liver diseases and hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2013年16期

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本文编号：414522