人3、7型腺病毒单克隆抗体制备及应用研究

发布时间：2017-06-03 15:16

  本文关键词：人3、7型腺病毒单克隆抗体制备及应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【目的】在先前的研究中，本课题组将人7型腺病毒的中和表位嵌入3型腺病毒载体衣壳，构建出人3、7型嵌合腺病毒rAdMHE3。本论文旨在用rAdMHE3作为抗原免疫小鼠，，并采用杂交瘤技术制备出针对人7型腺病毒的具有中和活性的单克隆抗体（中和单抗），探讨采用衣壳嵌合策略构建的重组腺病毒用作免疫原，制备针对嵌入的中和表位的中和单抗的可行性；制备出人3型腺病毒的中和单抗，并用这些单抗对人3型腺病毒的中和表位进行鉴定；制备出针对人3型腺病毒的一系列单抗，并从中筛选出腺病毒直接免疫荧光法检测用的单抗，为建立腺病毒的直接免疫荧光检测方法奠定基础。 【方法】用HEp-2细胞或AD293细胞扩增rAdMHE3，后者用氯化铯梯度离心纯化后免疫BALB/c小鼠，用杂交瘤技术制备出针对rAdMHE3的单抗。用体外腺病毒中和实验筛选出中和单抗，蛋白免疫印迹实验（Western blot）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和抗体结合竞争ELISA对中和单抗进行鉴定。用直接免疫荧光实验筛选出腺病毒直接免疫荧光法检测用的单抗。 【结果】共获得22株针对rAdMHE3的单抗，从中经体外腺病毒中和实验筛选出3株特异中和人3型腺病毒的单抗、4株特异中和人7型腺病毒的单抗。经进一步鉴定，4株人7型腺病毒中和单抗均识别7型腺病毒的六邻体高变区5内的血清型特异性中和表位，并且该表位被证明是构象表位；3株人3型腺病毒中和单抗识别的表位均为线性表位，且该表位位于3型腺病毒的六邻体高变区4。经直接免疫荧光实验，筛选出4株单抗可特异识别人7型腺病毒，2株单抗可特异识别人3型腺病毒，10株单抗可识别人3、4和7型腺病毒。 【结论】本论文初步证明了，中和表位衣壳嵌合策略构建的重组腺病毒用于制备针对嵌入的中和表位的中和单抗是可行的；人7型腺病毒的六邻体高变区5内的血清型特异性中和表位为构象表位；人3型腺病毒的六邻体高变区4内可能含有线性的血清型特异性中和表位。
【关键词】：人腺病毒 衣壳嵌合 高变区 中和表位 单克隆抗体
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 主要符号表11-12
• 前言12-16
• 1 采用衣壳嵌合策略构建的重组腺病毒在单克隆抗体的制备中的应用12
• 2 治疗性抗体在病毒感染性疾病中的应用12-13
• 3 腺病毒感染和腺病毒中和表位鉴定13-16
• 材料和方法16-30
• 1 材料16-18
• 1.1 菌株和质粒16
• 1.2 动物、细胞和病毒株16-17
• 1.3 试剂和耗材17-18
• 1.4 主要仪器18
• 2 人 7 型腺病毒六邻体高变区 5（HAdv-7 HVR5）肽合成、偶联及GST-HVR5 融合蛋白表达18-20
• 2.1 HAdv-7 HVR5 肽的化学合成及偶联18
• 2.2 氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞及转化18-19
• 2.3 HVR5-GST 融合蛋白的表达与纯化19-20
• 3 重组病毒大量培养与纯化20-21
• 4 rAdMHE3 单克隆抗体制备21-23
• 4.1 免疫小鼠21-22
• 4.2 免疫后脾细胞和杂交瘤细胞融合22
• 4.3 阳性杂交瘤的筛选、单克隆及诱导腹水22-23
• 4.4 阳性杂交瘤的单克隆及诱导腹水23
• 5 rAdMHE3 腹水效价的测定23
• 6 抗体亚类分析23-24
• 7 腹水纯化24
• 8 单抗辣根过氧化物酶（HRP）标记24-25
• 9 体外腺病毒中和实验25
• 10 人腺病毒 7 型中和抗体的鉴定25-27
• 10.1 抗体结合竞争 ELISA25
• 10.2 重组腺病毒结合实验25-26
• 10.3 小鼠免疫血清的制备26
• 10.4 人 3 型和 7 型腺病毒六邻体重组蛋白（A3H 和 A7nH）、HVR5-GST融合蛋白（GST-A7R5）和 BSA 偶联 HVR5 合成肽（BSA-A7R5）结合实验26
• 10.5 免疫印迹实验26-27
• 11 针对 Ad3EGFP 的中和单抗鉴定27-29
• 11.1 腺病毒结合实验27
• 11.2 六邻体重组蛋白 A3H 和 A7nH 结合实验27-28
• 11.3 免疫印迹分析28
• 11.4 GST 融合肽结合实验28-29
• 12 直接免疫荧光实验29
• 12.1 异硫氰酸荧光素（FITC）标记单抗29
• 12.2 直接免疫荧光实验29
• 13 统计分析29-30
• 结果30-44
• 1 针对 HAdv-7 的中和单抗鉴定31-36
• 1.1 抗体结合竞争 ELISA31-32
• 1.2 腺病毒结合实验32-34
• 1.3 免疫印迹实验34
• 1.4 血清体外腺病毒中和实验34-36
• 1.5 重组蛋白和合成肽结合实验36
• 2 针对 Ad3EGFP 的中和单抗鉴定36-39
• 2.1 免疫印迹分析36-37
• 2.2 腺病毒结合实验37-38
• 2.3 重组蛋白结合实验38-39
• 3 直接免疫荧光实验39-44
• 讨论44-47
• 结论47-48
• 参考文献48-52
• 综述52-68
• 参考文献61-68
• 攻读学位期间取得的研究成果68-69
• 致谢69-70

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 陈娜娜;向冬喜;郑丛龙;;腺病毒及其研究进展[J];大连医科大学学报;2010年05期

2 黄国虹;许文波;;腺病毒新型别的研究进展[J];病毒学报;2013年03期

3 马春玲;卢山;;人类腺病毒受体的研究进展[J];微生物与感染;2008年04期

4 王芳;苏晓波;张岚;;Varp过表达降低腺病毒感染细胞效率的研究[J];激光生物学报;2013年05期

5 陈兆平;周忆萍;胡诞宁;;眼部腺病毒感染:第一部份 流行性角膜结膜炎病原体分离和鉴定[J];眼科研究;1983年02期

6 尚守礼;丛树梅;彭永范;;济南地区腺病毒感染的病原学研究[J];微生物学报;1966年01期

7 王素华;;以腺病毒为载体的基因疗法[J];检验检疫学刊;2009年02期

8 赵俊丽;夏海滨;;腺病毒的标记方法[J];生命的化学;2010年04期

9 高步先;张德礼;;人类腺病毒分子生物学及用作基因工程载体的特性[J];生物工程进展;1997年01期

10 黄志英;程宝金;林红;张小玉;万瑜;;80例住院患儿腺病毒呼吸道感染的流行病学特点和临床特征分析[J];病毒学报;2014年04期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 卓婕;孙永昌;李莉;段招军;;一种新型腺病毒引起的重症肺炎及其传播:病例报告[A];中华医学会呼吸病学年会——2011（第十二次全国呼吸病学学术会议）论文汇编[C];2011年

2 闫明哲;熊鹰;刘映乐;;武汉市儿童2010-2012年腺病毒呼吸道感染的分子流行病学调查[A];2012年湖北生物产业发展高端论坛暨湖北省生物工程学会2012年度学术交流会论文汇编[C];2012年

3 东丽丽;卢美萍;马莉亚;陈志敏;滕丽萍;徐益萍;顾伟忠;;2006-2012年杭州地区儿童下呼吸道腺病毒感染流行情况调查[A];2012年江浙沪儿科学术年会暨浙江省医学会儿科学分会学术年会、儿内科疾病诊治新进展国家级学习班论文汇编[C];2012年

4 马莉亚;东丽丽;卢美萍;滕丽萍;钟永兴;徐益萍;徐迎春;王颖硕;鲍兴儿;陈志敏;;479例儿童下呼吸道腺病毒感染的临床特征分析[A];中华医学会第十七次全国儿科学术大会论文汇编（下册）[C];2012年

5 马莉亚;东丽丽;卢美萍;钟永兴;徐迎春;王颖硕;鲍兴儿;陈志敏;滕丽萍;徐益萍;;479例儿童下呼吸道腺病毒感染的临床特征分析[A];2012年江浙沪儿科学术年会暨浙江省医学会儿科学分会学术年会、儿内科疾病诊治新进展国家级学习班论文汇编[C];2012年

6 李子建;刘元东;靳晓红;崔玉玲;黄尉初;;一起由腺病毒引起的发热性呼吸道传染病疫情的调查[A];华东地区第十次流行病学学术会议暨华东地区流行病学学术会议20周年庆典论文汇编[C];2010年

7 马莉亚;东丽丽;卢美萍;滕丽萍;钟永兴;徐益萍;徐迎春;王颖硕;鲍兴儿;陈志敏;;479例儿童下呼吸道腺病毒感染的临床特征分析[A];中华医学会第十三届全国儿科呼吸学术会议论文汇编[C];2012年

8 陈刚;沈小燕;林旭;林丽香;;NF-κB特异的RNAi腺病毒载体的构建及其对人脐静脉内皮细胞增殖凋亡的影响[A];2008中国医师协会内分泌代谢科医师分会年会论文汇编[C];2008年

9 陈刚;乔玉芳;林旭;林丽香;;NF-κB特异的RNAi腺病毒载体的构建及其对血管内皮细胞增殖凋亡的影响[A];2008中国医师协会内分泌代谢科医师分会年会论文汇编[C];2008年

10 李全海;胡洁;魏林;;替代的11型或35型刺突的5型腺病毒可提高对人细胞的感染性并可通过CD46依赖和CD46非依赖感染方式表达目的基因[A];河北省免疫学会第六次免疫学大会资料汇编[C];2010年

中国重要报纸全文数据库 前4条

1 湖南省儿童医院 张聪;腺病毒也是腹泻“元凶”[N];大众卫生报;2012年

2 武汉大学人民医院副研究员 罗照春;感染病毒 可致肥胖[N];健康报;2007年

3 记者 卢丽涛;保定部队医院腺病毒疫情已被控制[N];第一财经日报;2012年

4 张建中;肥胖之因也许是病毒[N];健康报;2000年

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 薛惠斌;腺病毒CNHK200-hEndostatin的质量控制及其大规模扩增、纯化的初步研究[D];第二军医大学;2007年

2 陈清烽;靶向CX3CL1的RNA干扰在病毒性肝炎及癌症中的治疗作用[D];中国科学技术大学;2008年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 王s

本文编号：418512