杂合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4在毕赤酵母中的分泌表达及活性检测

发布时间：2017-06-03 18:03

  本文关键词：杂合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4在毕赤酵母中的分泌表达及活性检测，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 将两种抗菌肽优化后的基因片段进行拼接，通过构建携带融合基因的表达载体pPICZαA-cp1-ds4并在毕赤酵母X-33中高效分泌表达，并研究杂合抗菌肽Cecropinp1-Dermaseptin S4的抗菌活性、稳定性及抗肿瘤活性。 方法： 1．将两种抗菌肽氨基酸序列组合在一起利用Antheprot release5.0预测杂合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4的二级结构，利用The antimicrobial peptidesdatabases(APD)预测杂合抗菌肽的理化性质及成为抗菌肽的可能性。 2.抗菌肽Dermaseptin S4基因的克隆：根据毕赤酵母的密码子偏爱性和Genbank中Dermaseptin S4的氨基酸序列以及部分Cecropin P1C-末端的部分氨基酸序列，设计适当的拼接引物通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）进行拼接，将拼接产物克隆至pMD18-T载体转化大肠杆菌DH5α后测序。 3.杂合抗菌肽基因的克隆：分别以保存Cecropin P1和Dermaseptin S4正确序列的pPICZαA-cp1和pMD18T-ds4质粒为模板，以各自特异性引物为引物进行PCR扩增后通过SOE-PCR拼接两基因片段，，将拼接片段克隆至pMD18-T载体转化大肠杆菌DH5α后测序。 4.表达载体pPICZα-cp1-ds4的构建：重组质粒pMD18T-cp1-ds4和表达载体pPICZα-A分别经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后利用T4DNA连接酶进行连接并转化大肠杆菌DH5α后测序。 5.重组酵母菌pPICαA-cp1-ds4/X-33的构建：将表达载体pMD18T-cp1-ds4经Sac I线性化后，采用EMC830电穿孔仪低电压模式电转化酵母并利用100mg/L Zeocin进行筛选。 6.重组子诱导表达及初步活性检测：采用BMGY和BMMY诱导培养基以0.5%（v/v）甲醇浓度进行培养，利用Tricine-SDS-PAGE检测目的多肽的表达并采用琼脂扩散法检测浓缩上清中杂合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4的抗菌活性。 7.表达产物的纯化：通过提高Zeocin的浓度筛选多拷贝酵母重组子，利用BMGY和BMMY诱导培养基培养并采用AKTA蛋白纯化系统进行纯化。 8.抗菌谱及最小抑菌浓度测定：分别采用琼脂扩散法和微量稀释法测定杂合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4的抗菌谱及最小抑菌浓度。 9.采用Hultmark等通过计算抗菌活力来表征抗菌肽的抑菌能力的方法衡量杂合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4的热稳定性、酸碱稳定性及胰酶消化稳定性。 10.采用MTT法来研究杂合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4作用于小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的效果。 结果： 1.经Antheprot release5.0预测杂合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4的二级结构发现杂合多肽依然能够保持N-末端和C-末端为双螺旋结构，两螺旋结构之间存在疏松了连接片段，经APD预测杂合抗菌肽有成为抗菌肽的可能。 2.经SOE-PCR成功将拼接引物拼接成Dermaseptin S4基因，大小约120bp，将其克隆至pMD18-T载体后转化大肠杆菌DH5α并测序，测序结果显示序列与设计序列一致。 3.经SOE-PCR成功将Cecropin P1和Dermaseptin S4基因片段拼接后，将其克隆至pMD18-T载体后转化大肠杆菌DH5α并测序，测序结果显示序列与设计序列一致。 4. pMD18T-cp1-ds4和表达载体pPICZα-A经双酶切、酶连反应后，重组表达质粒转化大肠杆菌DH5α并测序，测序结果显示开放阅读框完全正确，所编码的氨基酸序列与设计一致。 5.表达载体pPICαA-cp1-ds4经Sac I线性化后在ECM830低电压模式（电压为350V，脉冲时间15s，脉冲次数1次）下可成功电转化毕赤酵母X-33，用Zeocin筛选得到阳性重组子。 6.琼脂扩散法初步检测对大肠埃希菌和经黄色葡萄球菌的作用效果，加入浓缩表达上清均有抑菌环形成。 7.提高Zeocin浓度筛选多拷贝重组子，结果得到的菌株对Zeocin最大的耐受浓度为400mg/L，用多拷贝重组子表达目的多肽其产量约为30mg/L，经AKTA蛋白纯化系统纯化后可得一特异性蛋白条带。 8.抗菌谱测定实验中对选取的大肠杆菌DH5α、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、志贺氏菌SDCDC563、鼠伤寒沙门氏菌CMCC50222均有抑制作用其最小抑菌浓度分别约为37.5μg/ml、75ug/ml、75ug/ml、150ug/ml、150ug/ml、150ug/ml，对铜绿假单孢菌27853无效。 9.对杂合抗菌肽进行热、酸碱和胰酶消化后仍能保持较高的抑菌活力。 10.通过MTT实验，杂合抗菌肽对小鼠骨髓瘤细胞存在抑制作用。 结论： 能够利用基因工程手段成功分泌表达杂合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4，研究结果表明该杂合肽对多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌表现出抑菌作用，该杂合抗菌肽具有较好的热、酸碱和抗胰酶消化稳定性；对小鼠骨髓瘤细胞SP2/0有一定的抑制效果。
【关键词】：杂合抗菌肽 Cecropin P1 Dermaseptin S4 分泌表达 生物活性
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416
【目录】：

• 研究生导师及课题指导小组简介5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 主要符号14-16
• 第一章 前言16-24
• 1.1 抗菌肽概述16-17
• 1.2 抗菌肽分类17-18
• 1.3 抗菌肽作用机制18-20
• 1.4 应用及展望20-21
• 1.5 Cecropin P1 研究现状21
• 1.6 Dermaseptin S4 研究现状21-22
• 1.7 课题创新点及研究意义22-24
• 第二章 杂合抗菌肽 Cecropin P1-Dermaseptin S4 在毕赤酵母中的诱导表达24-48
• 2.1 材料与方法24-37
• 2.2 结果37-45
• 2.3 讨论45-48
• 第三章 杂合抗菌肽 CecropinP1-DermaseptinS4 的纯化及抗菌作用研究48-60
• 3.1 材料与方法48-53
• 3.2 结果53-58
• 3.3 讨论58-60
• 第四章 杂合抗菌肽 Cecropin P1-Dermaseptin S4 作用于小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 的效果研究60-64
• 4.1 材料和方法60-62
• 4.2 结果62-63
• 4.3 讨论63-64
• 结论64-65
• 参考文献65-71
• 附录71-78
• 综述78-90
• 参考文献86-90
• 攻读学位期间取得的研究成果90-91
• 致谢91

【参考文献】

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本文编号：418818