OCILRP2在小鼠T细胞活化中的共刺激作用及其机制

发布时间：2017-06-06 07:58

  本文关键词：OCILRP2在小鼠T细胞活化中的共刺激作用及其机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景 T淋巴细胞在体内主要介导细胞免疫应答，整个应答过程分为三个阶段：T细胞特异性识别抗原阶段，T细胞活化、增殖和分化阶段，T细胞应答的效应阶段。T细胞共刺激在T细胞活化、增殖、分化和生存中发挥重要作用。 共刺激涉及效应淋巴细胞表面配体受体的相互作用。破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2（Osteoclast inhibit lectin related protein2, OCILRP2）基因最初从成骨细胞中分离获得，它高表达于脾脏、胸腺、B淋巴细胞、DC及活化的T细胞中，而静止的T细胞中OCILRP2的表达水平很低。研究表明OCILRP2是小鼠T细胞活化共刺激中的一个重要的活化受体，其配体为NKRP1f。 OCILRP2是C型凝集素样受体分子。C型凝集素样受体分子在固有免疫及获得性免疫应答中通过与其配体结合而发挥重要的作用，其家族成员NKG2D缺少细胞质信号传导基序，因而通过与不同的接头蛋白结合激活NK细胞及CD8+T细胞。OCILRP2蛋白胞内段很短，同样缺少细胞质信号传导基序，不能传递信号，所以我们推测OCILRP2可能类似于NKG2D,通过与跨膜接头蛋白DAP12相互作用而活化下游信号通路。研究表明OCILRP2沉默的T细胞中酪氨酸磷酸化的lck减少，活化的T细胞中PI3-K的酪氨酸磷酸化不变。然而OCILRP2共刺激T细胞活化的确切机制及相关的信号转导通路尚不清楚。 目的 研究OCILRP2在小鼠T细胞活化过程中的共刺激作用及其机制，鉴定与OCILRP2发挥协同作用的接头蛋白，探索其介导T细胞活化的信号通路，丰富T细胞活化的共刺激理论，为深入理解T细胞活化的分子机制提供新线索。 方法 通过免疫共沉淀、GST pull down、激光共聚焦显微镜CLSM等实验鉴定与OCILRP2相互作用的接头蛋白分子。构建了全长、胞内段、胞外段加跨膜区重组OCILRP2蛋白，用来分析OCILRP2与接头蛋白分子相互作用的区域。CD3/CD28抗体及PMA刺激小鼠T淋巴瘤EL4细胞，，检测刺激前后细胞因子的分泌、细胞增殖、凋亡、细胞周期等生物学特征，运用荧光定量PCR技术检测某些转录因子的变化，同时用免疫印迹技术寻找与OCILRP2相关的信号转导通路。 结果 成功构建了GST-DAP12、GST-OCILRP2胞内段、GST-OCILRP2胞外段加跨膜区的融合蛋白，鉴定出OCILRP2与接头蛋白分子DAP12相互作用，且只有胞外段加跨膜区的重组蛋白可与DAP12蛋白质相互作用，DAP12与Ras不发生相互作用。 激光共聚焦结果显示OCILRP2与DAP12在EL4细胞膜上共定位。 静止的EL4细胞系中OCILRP2主要在细胞浆中表达，用CD3/CD28抗体激活的EL4细胞，受体由胞内转运到细胞表面，而用PMA处理的EL4细胞没有表现出这种易位现象。DAP12经抗体刺激前后其膜上蛋白表达情况不发生改变。 小鼠淋巴瘤细胞EL4在未受到任何刺激的情况下分泌IL-2的水平很低，经CD3/CD28抗体刺激后，EL4分泌IL-2的水平显著升高。并且随着CD3抗体浓度的升高和刺激时间的加长，IL-2的分泌水平也增高，摸索出CD3/CD28抗体刺激EL4细胞的最佳抗体浓度和刺激时间。不同处理组对EL4细胞进行刺激48h，发现加入了OCILRP2抗体组的IL-2的分泌水平有所降低。CD3/CD28抗体浓度增加，对EL4细胞增殖有促进作用，加入OCILRP2抗体组与沉默组EL4增殖情况较CD3/CD28抗体减慢。而加入外源性IL-2抗体并不影响EL4细胞的增殖。OCILRP2不影响EL4细胞的细胞周期。anti-OCILRP2抗体与si-OCILRP2质粒均能使EL4细胞的凋亡情况减少。 抗CD3/CD28抗体可明显促进IL-2, NF-κB, NF-AT, MAPK3, MAPK8mRNA合成。 OCILRP2沉默使MAPK3和MAPK8的活化减少。 结论 OCILRP2与DAP12相互作用，通过MAPK通路进行信号转导，从而为T细胞活化提供共刺激信号。
【关键词】：OCILRP2 DAP12 EL4 T细胞活化 信号转导通路
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392;R329.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 英文缩略词表12-13
• 引言13-15
• 1 材料与方法15-35
• 1.1 主要仪器设备15
• 1.2 主要试剂与材料15-17
• 1.3 主要试剂配制17-23
• 1.3.1 细胞培养所用试剂的配制17-18
• 1.3.2 细菌实验所用试剂的配制18
• 1.3.3 分子实验所用试剂的配制18-19
• 1.3.4 蛋白电泳所用溶液的配制19-23
• 1.3.5 激光共聚焦实验所用试剂的配制23
• 1.3.6 流式细胞术检测所用试剂的配制 FACS buffer(100mL)23
• 1.4 方法23-35
• 1.4.1 细胞复苏，培养，传代与冻存23-24
• 1.4.2 小鼠脾脏淋巴细胞分离24-25
• 1.4.3 分子克隆质粒载体的构建25
• 1.4.4 质粒提取25
• 1.4.5 胶回收25
• 1.4.6 酶切25
• 1.4.7 连接25
• 1.4.8 感受态的制备25-26
• 1.4.9 转化26
• 1.4.10 质粒 DNA 转染细胞26
• 1.4.11 细胞裂解及蛋白抽提26-27
• 1.4.12 BCA 法测浓度27
• 1.4.13 SDS-page 与 Western Blot27-29
• 1.4.14 CO-IP29
• 1.4.15 原核蛋白诱导表达29
• 1.4.16 原核蛋白纯化29-30
• 1.4.17 GST pull down30
• 1.4.18 免疫荧光激光共聚焦30
• 1.4.19 流式细胞术检测 EL4 细胞表面 OCILRP2 蛋白表达30-31
• 1.4.20 抗体包被的方法31
• 1.4.21 EL4 细胞/小鼠脾脏淋巴细胞的活化及其细胞因子的诱生31
• 1.4.22 EL4 细胞分泌 IL-2 水平的 ELISA 检测31
• 1.4.23 小鼠脾脏淋巴细胞分泌 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的 ELISA 检测31
• 1.4.24 细胞增殖实验31-32
• 1.4.25 细胞周期实验32
• 1.4.26 RNA 的提取32
• 1.4.27 cDNA 的合成32-33
• 1.4.28 Real time PCR 反应33
• 1.4.29 统计学方法33-35
• 2 结果35-49
• 2.1 OCILRP2 相互作用蛋白的鉴定35-39
• 2.1.1 GST-DAP12 原核蛋白的表达35
• 2.1.2 GST-OCILRP2 原核蛋白的表达35-36
• 2.1.3 GST pull down 验证 DAP12 与 OCILRP2 蛋白的相互作用36
• 2.1.4 CO-IP 验证 DAP12 与 OCILRP2 蛋白的相互作用36-37
• 2.1.5 DAP12 与 OCILRP2 蛋白结合位置分析37
• 2.1.6 激光共聚焦分析 OCILRP2 与 DAP12 在胞膜上的共定位37-38
• 2.1.7 OCILRP2 与 DAP12 结合的工作模型38-39
• 2.1.8 CO-IP 实验鉴定 DAP12 与 Ras 不发生相互作用39
• 2.2 OCILRP2 对 T 细胞功能的影响39-46
• 2.2.1 EL4 细胞中 OCILRP2 的沉默效果39-40
• 2.2.2 CD3/CD28 抗体在不同浓度及不同时间点刺激 EL4 分泌 IL-2 水平(pg/mL）比较40-41
• 2.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞分泌 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的 ELISA 检测（OD450）41
• 2.2.4 CD3/CD28 抗体、OCILRP2 抗体及沉默组对 EL4 细胞增殖的影响41-42
• 2.2.5 CD3/CD28 抗体、OCILRP2 抗体、沉默质粒、PMA 对 EL4 细胞周期的影响42-44
• 2.2.6 OCILRP2 对细胞凋亡的影响44
• 2.2.7 CD3/28 抗体、PMA 刺激对 EL4 细胞表面 OCILRP2 蛋白表达的影响44-45
• 2.2.8 CD3/28 抗体、PMA 刺激对 EL4 细胞表面 DAP12 蛋白表达的影响45-46
• 2.3 OCILRP2 信号转导通路的分析46-49
• 2.3.1 Western Blot 检测 OCILRP2 在细胞内的信号转导46-47
• 2.3.2 CD3/CD28 抗体刺激组、CD3/CD28/OCILRP2 抗体刺激组、正常 EL4 细胞组核转录因子基因表达差异的定量分析47-49
• 3 讨论49-53
• 4 结论53-55
• 5 参考文献55-57
• 文献综述57-67
• 参考文献64-67
• 致谢67-68
• 在读期间发表的学术论文及研究成果68-69

【共引文献】

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1 刘紫玲;肺炎支原体荚膜多糖结合DC-SIGN对DC分泌细胞因子及成熟的影响[D];南华大学;2013年

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本文编号：425722