自噬对张力诱导终板软骨细胞钙化的影响研究

发布时间：2017-06-10 16:06

  本文关键词：自噬对张力诱导终板软骨细胞钙化的影响研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:通过力学诱导大鼠腰椎的终板软骨细胞钙化，探讨在间断周期性牵张力体外条件下，自噬在终板软骨细胞钙化过程中的变化及意义。 方法:无菌操作台下，将大鼠腰椎的软骨终板分离取出，再通过Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶酶消化法及自然传代法来提取和培养终板软骨原代细胞，将第1代的终板软骨细胞均匀种植在表面铺有Ⅰ型胶原的BioFlexTM加力板上，待细胞贴壁并增殖达板面的80%～90%融合度，对加力组中终板软骨细胞加载频率为0.5Hz正弦波形，细胞牵拉形变幅度为10%的间歇循环张力（ICMT），每天均加力4小时，持续加力20天后观察；在加载张力的基础上，对加力加药组添加雷帕霉素（Rapamycin）浓度为1umol/L联合培养；对照组的终板软骨细胞则不加载ICMT刺激。通过LIVE/DEADò染色检测终板软骨细胞活性及存活率，采用茜素红染色和碱性磷酸酶染色检测终板软骨细胞钙化程度，通过MDC特异性染色观察细胞的自噬小泡，运用RealtimeRT-PCR和Western blotting检测软骨相关基因以及自噬相关基因的表达变化；运用激光共聚焦显微镜观察荧光标记的LC3基因的表达。 结果:LIVE/DEADò染色结果表明，对照组、加力组和加力加药组中终板软骨细胞的活力及粘附力无明显差异。Realtime RT-PCR和Western blotting的检测结果显示，在ICMT刺激下，，终板软骨细胞中自噬相关基因的表达水平出现明显下调。碱性磷酸酶染色和茜素红染色的实验结果表明：同对照组相比，添加雷帕霉素的加力加药组和加力组中终板软骨细胞在ICMT诱导下，出现明显的钙化结节；且加力加药组中终板软骨细胞的钙化程度明显低于加力组。Realtime RT-PCR的结果显示加力加药组和加力组的终板软骨细胞中软骨相关基因的表达水平明显低于对照组，且加力加药组细胞中软骨相关基因的表达水平高于加力组。 结论:本课题研究表明ICMT诱导终板软骨细胞钙化及抑制自噬的表达水平，而通过雷帕霉素上调自噬水平可以部分抑制细胞的钙化现象，我们推测自噬作为一种宿主保护机制，可能与张力诱导的终板软骨退变及椎间盘退变过程有关。
【关键词】：间断周期性牵张力 钙化 终板软骨细胞 自噬
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：

• 中英文缩略词对照表5-9
• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 前言13-16
• 研究内容与方法16-31
• 1. 研究内容16-17
• 1.1 大鼠终板软骨细胞的分离与培养16
• 1.2 观察对照组和加力组的终板软骨细胞表型的变化16
• 1.3 观察张力诱导后，终板软骨细胞自噬标志性基因的表达变化16
• 1.4 观察雷帕霉素对终板软骨细胞退变中自噬水平的变化及作用16-17
• 1.5 观察自噬在张力诱导终板软骨细胞退变过中的作用17
• 2. 材料17-19
• 2.1 细胞培养试剂和仪器17-18
• 2.2 力学刺激装置18
• 2.3 染色相关试剂18
• 2.4 RNA 提取，Realtime-PCR 试剂和仪器18-19
• 2.5 Western-blot 试剂和仪器19
• 3.方法19-29
• 3.1 大鼠腰椎原代终板软骨细胞的分离与培养19-20
• 3.2 细胞传代与分组20
• 3.3 细胞冻存与复苏20-21
• 3.4 细胞粘附力及活力检测21-22
• 3.5 钙化结节检测22-23
• 3.6 实时荧光定量 PCR 法测定基因 mRNA 的表达变化23-25
• 3.7 Western-blotting 法测定蛋白的表达25-28
• 3.8 MDC 染色步骤28
• 3.9 激光共聚焦检测细胞中 LC3 基因蛋白表达28-29
• 3.10 诱导实验29
• 4. 统计学方法29-30
• 5. 附：技术路线图30-31
• 结果31-39
• 讨论39-45
• 结论45-46
• 参考文献46-53
• 附录53-56
• 综述56-66
• 参考文献61-66
• 作者简介及读研期间主要科研成果66-67
• 致谢67-68

【参考文献】

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  本文关键词：自噬对张力诱导终板软骨细胞钙化的影响研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：439056