致死型埃博拉病毒核酸和抗体检测方法的建立

发布时间：2017-06-10 22:16

  本文关键词：致死型埃博拉病毒核酸和抗体检测方法的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：埃博拉病毒（EBOV）是一种可以引起人畜共患烈性传染病的病原体，引起的疾病称为埃博拉出血热。此病始发于1976年埃博拉河流域，故而得名。埃博拉出血热是一种最急性、烈性、致命的传染病。人一旦感染埃博拉病毒，死亡率可高达88%。世界卫生组织将埃博拉病毒视为对人类危害最为严重的病毒之一，将其列为第4级病毒，OIE将其列为A类疾病。虽然我国还没发现EBOV，但近年来随着我国与非洲国家贸易往来日益增加，该病对我国构成潜在的威胁。 为防止埃博拉出血热入我国，我们建立了两种针对埃博拉出血热快速、可靠的诊断技术。一种是将荧光定量RT—PCR技术用于埃博拉病毒核酸的检测，建立了检测扎伊尔型埃博拉病毒（ZEBOV）和苏丹型埃博拉病毒（SEBOV）糖蛋白（GP）的荧光定量RT-PCR检测方法。为了保持荧光定量RT-PCR法的实用性，我们选择了高度保守糖蛋白作为扩增区域设计引物和探针。通过条件优化，以10倍系列稀释质粒pblue-SG，pblue-ZG为标准品，进行Real-time PCR扩增，制作标准曲线，并进行重复性、准确性检验及特异性检测。Real-time PCR检测结果表明，苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒标准曲线相关系数均大于0.99，灵敏度可达1.0×101拷贝，高于常规PCR方法的106～107；同时，7种其他对照烈性病病原体检测均呈阴性，特异性好。另一种是以埃博拉病毒（EBOV）保守性较高的VP40基因原核表达产物为抗原建立检测埃博拉出血热抗体的间接ELISA方法。构建VP40蛋白原核表达载体pET22b(+)-VP40，并转化至BL21(DE3)菌，在1.0mmol/L IPTG和37℃条件下诱导表达目的蛋白，经Ni-NTA亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。以该纯化蛋白为包被抗原建立监测埃博拉出血热抗体的间接ELISA方法，其敏感性和特异性均为100%。 综上所述，本实验建立的两种检测致死型EBOV的方法均具有较高的特异性、敏感性和稳定性，，为埃博拉出血热的快速确诊和流行病调查奠定了基础。
【关键词】：埃博拉病毒 Real-time PCR VP40蛋白 间接ELISA 检测方法
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S852.65;R373
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-5
• 前言5-6
• 第一篇 文献综述6-17
• 第一章 埃博拉出血热的研究进展6-17
• 1.1 埃博拉出血热概述6-11
• 1.2 埃博拉出血热诊断方法概述11-15
• 1.3 小结15-17
• 第二篇 埃博拉出血热诊断方法研究内容17-36
• 第一章 致死型埃博拉病毒核酸 Real-Time PCR 检测方法的建立17-26
• 1.1 材料17-18
• 1.2 方法18-20
• 1.3 结果20-24
• 1.4 讨论24-25
• 1.5 小结25-26
• 第二章 埃博拉病毒 VP40 蛋白的原核表达及其间接 ELISA 检测方法的建立26-36
• 2.1 材料26-27
• 2.2 方法27-30
• 2.3 结果30-35
• 2.4 讨论35
• 2.5 小结35-36
• 结论36-37
• 参考文献37-44
• 作者简介44-45
• 致谢45

【参考文献】

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本文编号：440111