刚地弓形虫14-3-3蛋白真核表达载体的构建与表达

发布时间：2017-06-13 11:10

  本文关键词：刚地弓形虫14-3-3蛋白真核表达载体的构建与表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：刚地弓形虫是一种呈世界性分布的重要机会性致病原虫,专性寄生细胞内,人与动物均能感染,引起人兽共患弓形虫病。正常情况下,宿主感染弓形虫后,呈隐性状态。但在宿主免疫功能低下时,如器官移植、AIDS、恶性肿瘤等患者,弓形虫可引起器官损害,导致严重后果。孕妇感染弓形虫可致流产、死产和早产,存活者也常患有畸形和智力障碍等严重后遗症。除感染人外,弓形虫也可感染家畜,引起羊等多种家畜的流产和大量死亡,给全世界的畜牧业造成了巨大的经济损失和影响其发展。同时,带虫家畜是人感染弓形虫的主要传染源。 近年来,在真核细胞内信号传导通路研究中,发现了一组关键信号蛋白14-3-3蛋白家族。14-3-3蛋白是广泛存在于植物、酵母、原虫、蠕虫、昆虫和包括人在内的多种动物真核细胞内的一种高度保守蛋白。它参与很多细胞正常生命活动的调节。据资料推测,14-3-3蛋白也可能在弓形虫细胞信号转导中起重要的调节作用。 目的：构建刚地弓形虫RH株14-3-3蛋白的真核表达载体,并在真核细胞内表达该载体,为研究弓形虫中此蛋白的功能奠定基础。 方法：首先利用生物信息学方法对弓形虫14-3-3蛋白的理化性质和结构进行预测。用基因工程的方法,以弓形虫RH株总RNA为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段。与pEASY-T1克隆载体连接,筛选出阳性克隆,经PCR和双酶切鉴定后,亚克隆至真核表达载体pEGFP-C1。经过PCR、双酶切和测序鉴定后,将构建好的真核表达载体pEGFP/14-3-3转染HEK293细胞,用荧光显微镜观察其在HEK293细胞内表达情况,Western-blot鉴定表达产物。 结果：预测14-3-3蛋白分子为酸性可溶性蛋白。14-3-3二级结构由Alpha helix(Hh)、Extended strand(E)e及Random coil(Cc)组成。3D结构显示14-3-3蛋白主要以同源或异源二聚体存在,形成一个U型结构。14-3-3单体是由9个反向平行的a螺旋(Hh)构成。发现约5个氨基酸保守序列区,与结构和功能相关的位点高度保守。RT-PCR扩增出的基因片段约800bp,构建的真核表达质粒pEGFP/14-3-3经PCR、双酶切鉴定正确。测序结果表明,其具有一个801bp完整的开放阅读框,与GenBank中刚地弓形虫14-3-3蛋白基因序列(登录号为AB012775.1)同源性为99%。荧光显微镜下观察到重组质粒能够在HEK293细胞中表达。, Western-blot分析结果显示,在转染pEGFP/14-3-3重组质粒的细胞中,存在表达的弓形虫14-3-3蛋白,相对分子质量约为30000。 结论：对14-3-3蛋白生物学信息预测及真核表达重组质粒pEGFP/14-3-3的成功构建,为下一步进行14-3-3蛋白的研究奠定基础。
【关键词】：刚地弓形虫 14-3-3蛋白 真核表达 生物信息学
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R382.5;Q78
【目录】：

• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 符号说明10-12
• 前言12-17
• 材料17-20
• 试验方法20-36
• 结果36-44
• 讨论44-47
• 参考文献47-50
• 附图50-51
• 致谢51-52
• 攻读学位期间发表的学术论文目录52-53
• 附件53

【参考文献】

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1 都建,沈继龙,王维,李小月,胡元生,钟政荣,刘淼;弓形虫信号转导蛋白14-3-3的高效表达及免疫学诊断的初探[J];中国生物制品学杂志;2005年01期

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本文编号：446414