TAT-NLS-Nkx6.2融合蛋白功能的初步研究

发布时间：2017-06-13 12:20

  本文关键词：TAT-NLS-Nkx6.2融合蛋白功能的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：由同源盒基因Nkx6.2编码产生的同源结构域Nkx6.2作为一种反式作用因子,在少突胶质细胞特化、成熟及髓鞘形成过程中和中枢神经系统(central nervous system,CNS)胚胎期神经母细胞特化生,都发挥重要的调控作用。本实验室在前期研究过程中发现,脑发育时期甲状腺激素(thyroid hormone, TH)不足会造成CNS内重要神经细胞异常,同时伴随Nkx6.2低表达。但是,由于TH不足导致的脑发育迟滞的病理过程中,转录因子Nkx6.2参与的具体机制尚不明确。我们希望通过给予甲状腺功能减低模型添加外源性Nkx6.2的方法,可以有助于解决或部分解决这一问题。 本课题组前期工作将Nkx6.2与核定位信号(nuclear location sequence, NLS)、TAT蛋白转导域(protein transduction domain, PTD)一起构建重组表达质粒pET-28a-TN-NKx6.2。本文将该重组表达质粒pET-28a-TN-NKx6.2转染神经细胞并表达,细胞荧光免疫确定其表达产物可以进入神经细胞细胞核。之后对实验室前期获得的纯化TAT-NLS-Nkx6.2融合蛋白,进行荧光染料Cy7-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Cy7-N-hydroxysuccinimide ester, Cy7NHS)的标记。随后向小鼠尾静脉注射Cy7-TN-Nkx6.2,应用活体荧光成像系统监测融合蛋白TN-Nkx6.2在小鼠脑部的动态分布,结果证明该融合蛋白能够通过血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)进而到达脑组织；同时通过免疫荧光组化实验表明该融合蛋白可以内化进入神经细胞胞浆、胞核。最后向神经干细胞中加入融合蛋白TN-Nkx6.2继续培养,细胞荧光免疫反应观察不同培养不同时间段神经细胞分化情况,发现融合蛋白TN-Nkx6.2可以促进神经干细胞的分化,尤其是促进神经干细胞向少突胶质细胞特化,促进神经干细胞的成熟。
【关键词】：同源盒基因Nkx6.2 pET-28a质粒 TAT-NLS-Nkx6.2融合蛋白 活体荧光成像 神经干细胞
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3411;Q78
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-9
• ~.略语/符号说明9-11
• 前言11-15
• 研究现状、成果11-13
• 研究目的、方法13-15
• 一、TN-Nkx6.2 基因在神经细胞的表达15-23
• 1.1 实验对象15-17
• 1.1.1 菌株、载体和实验动物15-16
• 1.1.2 工具酶及分子量标志物16
• 1.1.3 主要化学试剂16
• 1.1.4 实验仪器16-17
• 1.1.5 培养液17
• 1.2 试验方法17-19
• 1.2.1 分离并培养大鼠神经细胞17-18
• 1.2.2 pET-28a-TN-Nkx6.2转染神经细胞18-19
• 1.2.3 细胞免疫荧光检测pET-28a-TN-Nkx6.2在神经细胞的表达19
• 1.3 实验结果19-21
• 1.3.1 pET-28a-TN-Nkx6.2鉴定19
• 1.3.2 细胞免疫荧光检测pET-28a-TN-Nkx6.2在神经细胞的表达19-21
• 1.4 讨论21-22
• 1.4.1 免疫荧光细胞化学技术21
• 1.4.2 神经细胞培养21
• 1.4.3 阳离子脂质体介导的转染21-22
• 1.5 小结22-23
• 二、TN-Nkx6.2 融合蛋白在小鼠脑中分布的鉴定23-33
• 2.1 对象和方法23-24
• 2.1.1 实验动物23
• 2.1.2 主要试剂及试剂盒23-24
• 2.1.3 实验仪器24
• 2.2 实验方法24-27
• 2.2.1 Cy7 NHS标记融合蛋白TN-Nkx6.224-25
• 2.2.2 标记效率F/P值计算25
• 2.2.3 活体荧光成像系统分析TN-Nkx6.2在小鼠脑内分布25
• 2.2.4 免疫荧光组化观察TN-Nkx6.2在小鼠脑组织分布情况25-26
• 2.2.5 TUNEL试剂盒染色26
• 2.2.6 观察指标和统计方法26-27
• 2.3 结果27-30
• 2.3.1 Cy7-TN-Nkx6.2融合蛋白在脑中的动态分布27-29
• 2.3.2 荧光免疫组化染色观察TN-Nkx6.2在小鼠脑组织分布29
• 2.3.3 各组小鼠大脑皮层细胞凋亡指数比较29-30
• 2.4 讨论30-32
• 2.4.1 荧光成像技术及在神经科学中的应用30-31
• 2.4.2 KODAK活体动物成像系统31-32
• 2.5 小结32-33
• 三、融合蛋白TN-Nkx6.2对神经干细胞分化的影响33-43
• 3.1 实验对象33-34
• 3.1.1 实验动物33
• 3.1.2 主要仪器33
• 3.1.3 实验试剂33
• 3.1.4 部分试剂的配制33-34
• 3.2 实验方法34-36
• 3.2.1 提取并培养神经干细胞34-35
• 3.2.2 免疫荧光细胞化学检测分化情况35-36
• 3.2.3 统计学方法36
• 3.3 结果36-41
• 3.3.1 神经干细胞的形态36
• 3.3.2 神经干细胞分化鉴定36-38
• 3.3.3 Nkx-6.2蛋白对神经干细胞分化的影响38-41
• 3.4 讨论41-42
• 3.5 小结42-43
• 结论43-44
• 参考文献44-48
• 发表论文和参加科研情况说明48-49
• 附录49-54
• 综述 同源盒基因Nkxs对低典大鼠甲低影响的研究进展54-64
• 综述参考文献58-64
• 致谢64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 季丽莉;佟雷;王振宇;;神经干细胞的生物学特性和体外培养鉴定[J];解剖科学进展;2007年02期

2 李榕;伍思霖;王霞;王凯;苟兴春;;TAT蛋白及其转导技术在中枢神经系统研究中的应用[J];神经解剖学杂志;2011年04期

3 支德福;王冰;崔韶辉;杨宝灵;赵不凋;赵轶男;姜云霞;于世钧;张树彪;;两种阳离子脂质体介导基因转染的比较研究[J];药学学报;2009年05期

4 梁东春,吴伊丽,郭刚,赵学勤,张镜宇;碘缺乏对大鼠胰岛素样生长因子1基因表达的影响[J];中国地方病学杂志;2003年01期

5 朱淼鑫;姚明;;小动物活体成像技术的应用[J];中国比较医学杂志;2011年03期

6 苏青,罗敏,陈源,刘红标,陆志强,陈家伦;甲状腺激素缺乏对发育期鼠脑蛋白激酶C活性的影响[J];中华内分泌代谢杂志;2000年02期

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本文编号：446530