耐甲氧西林金黄色葡萄球菌主要流行克隆替代的机制研究

发布时间：2017-06-14 06:10

  本文关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌主要流行克隆替代的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，简称金葡菌)是重要的人类病原菌，除可引起人类皮肤和软组织化脓性感染外，尚可致肺炎、关节炎、骨髓炎、剥脱性皮炎、胃肠炎、脓毒血症、毒性休克综合征等多种疾病，严重危害人类健康。随着抗生素在临床的广泛使用，金葡菌的耐药性不断增强，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的出现及其耐药性的快速增长，目前已成为全球院内获得性感染的首要病原菌，引起全球卫生领域的高度关注。美国2005年因MRSA感染导致的死亡人数就已经超过乙型肝炎和艾滋病的总和；我国耐药监测网的12家医院2011年向美国JMI实验室提供的2278株医院感染细菌中，金葡菌分离率排第一位(占15.1%，343/2278)。有研究者将MRSA、HBV、HIV称为当前全球三大感染性病原微生物。 应用金葡菌的分子分型方法，如葡萄球菌染色体盒(staphylococcal cassettechromosome mec， SCCmec)分型，染色体脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gelelectrophoresis，PFGE)分析,多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST),以及葡萄球菌A蛋白基因分型(staphylococcal protein A gene typing, spa)等，对不同地区的流行分离株进行分析后发现：特定地区的金葡菌感染主要由少数几个优势克隆群(clonal complex, CC)引起。如美国流行的最主要金葡菌克隆群是USA300(CC8),英国等欧洲国家主要是CC22和CC30，而亚洲国家最主要的流行克隆群是ST239。Liu等(2009)对我国14个城市的MRSA菌株进行分析鉴定发现，ST239是我国最主要的MRSA克隆群，占80.8%(567/702)。我们课题组前期对分离自重庆、上海、北京、广州、沈阳、乌鲁木齐等6城市的309株MRSA进行分子分型研究也发现ST239占51.5%(159/309)。MRSA的分子流行病学研究还发现：特定地区流行的MRSA菌株克隆群不是恒定不变的，而是存在克隆群相互替代的现象。如在英国，CC22MRSA克隆群在2001~2007年间逐渐取代了CC30而成为最主要的流行克隆群；在德国，一家医院经过11年的监测研究发现, CC45-MRSA-IV和CC5/ST228-MRSA-I两个克隆群逐步被CC22-MRSA-IV和CC5-MRSA-II所取代；在匈牙利，1994年到1998年之间最主要的流行MRSA克隆群为ST239，然而自2001年至2004年间被ST228和ST5克隆群所取代。我国最主要的ST239MRSA克隆群内有2个优势克隆，ST239-MRSA-III-t037和ST239-MRSA-III-t030。研究发现，，2000年之前ST239-MRSA-III-t037为我国流行的第一大MRSA克隆，但2000年之后该克隆的地位被ST239-MRSA-III-t030克隆取代，这种克隆群之内的克隆替代现象尚未在国际上其它地区发现，开展对其替代机制的研究，不仅对理解我国最主要克隆群内克隆的更替有重要意义，而且可为针对性研发新型抗MRSA感染药物提供重要参考依据。 MRSA克隆群或克隆的替代机制复杂，菌株本身的特性、抗生素的使用与选择压力、地理因素、人群流动、环境因素、适应性代价(fitness cost)等都可能对特定地区的MRSA克隆的变迁产生影响。在法国，研究者发现庆大霉素敏感的MRSA克隆(GS-MRSA clone)逐步取代了庆大霉素耐药的克隆(GR-MRSA clone)(Laurent etal.2001)，说明MRSA会为对特定抗生素的耐药性付出更多代价。Lee等(2007)研究发现，MRSA携带SCCmec元件的不同对菌株的适应性也有影响，如携带SCCmec I型细菌比SCCmec IV型菌具有更强的葡萄糖代谢能力和相对高的生长速率，这也许是在临床分离株中SCCmec I型MRSA菌比IV型更常见的原因。我国流行的ST239-MRSA-III-t037和ST239-MRSA-III-t030均携带同一种SCCmec，即SCCmec III，那么发生在我国的ST239-MRSA-III-t030替代ST239-MRSA-III-t037的机制也许更为复杂。本课题组前期从我国6座城市9所医院的MRSA分离株中，鉴定出ST239-MRSA-III克隆株159株，其中ST239-MRSA-III-t030占56.6%(90/159)，ST239-MRSA-III-t037占30.2%(48/159)(Cheng et al.2013)。有趣的是，我们也发现大多数ST239-MRSA-III-t030菌株都对利福平耐药而对复方新诺明敏感，而ST239-MRSA-III-t037菌株都对利福平敏感且大多数对复方新诺明耐药，这一独特的耐药现象是否在我国MRSA克隆的替代中发挥作用尚不清楚。为探索我国ST239-MRSA-III-t030替代ST239-MRSA-III-t037而成为最主要流行克隆的机制，本研究从重庆、上海、广州三个地区分离的ST239-MRSA-III-t030和ST239-MRSA-III-t037菌株随机抽出24株(每地8株)配成12个t030/t037菌株对，采用生长曲线测定、体外竞争实验、交叉抑制实验，体内竞争实验、耐药性再检测、耐药决定簇分析及相关基因表达水平的检测等方法，深入探讨ST239-MRSA-III-t030克隆的生存优势以及与耐药性的关系，发现ST239-MRSA-III-t030较ST239-MRSA-III-t037有更强的生存能力，这种生存优势可能与ST239-MRSA-III-t030菌株普遍存在利福平耐药，而ST239-MRSA-III-t037普遍存在复方新诺明耐药有关。主要研究内容和结果分述如下： 1. MRSA菌株耐药谱的再测定：前期收集的为各临床实验室的药敏试验结果，为统一标准，采用BHI肉汤稀释法检测了24株MRSA对利奈唑胺，替考拉宁，万古霉素,苯唑西林,克林霉素,利福平,复方新诺明的药物敏感性。结果发现24株菌株均对利奈唑胺，替考拉宁和万古霉素敏感，对苯唑西林耐药，有11株对克林霉素耐药(CQ08除外)；12株ST239-MRSA-III-t030菌株都对利福平耐药且均对复方新诺明敏感；相反，12株ST239-MRSA-III-t037菌株都对利福平敏感，其中11株对复方新诺明耐药(SH02除外)。 2. MRSA菌株的生长曲线测定：采用TSB培养基，体外对12对金葡菌的生长曲线进行检测分析。结果11个MRSA菌株对中ST239-MRSA-III-t030菌株表现出显著较短的生长迟缓期，培养24小时后能够检测到较高的OD600吸光度值。剩下一组(SH05/SH39)菌株的生长迟缓期虽然相似，但在培养24小时后ST239-MRSA-III-t030菌株也可以达到更高的OD600吸光度值。表明在独立生长的情况下，ST239-MRSA-III-t030菌株较ST239-MRSA-III-t037生长更快，在培养24h后能达到更高的生长量。 3.体外竞争与交叉抑制实验：①将24株细菌的过夜培养物分别稀释至0.5个麦氏浓度，各取100μl按12个菌株对进行1：1混合，接种于新鲜BHI培养基，37℃培养24小时，利用ST239-MRSA-III-t030和ST239-MRSA-III-t037对抗生素敏感性不同，采用稀释铺板计数法检测混合培养后各克隆的菌落总数，计算t030/t037的比值。结果12对菌株中有9对ST239-MRSA-III-t030在培养24小时后菌落数目显著高于ST239-MRSA-III-t037，还有1对的t030/t037的比值大于1，但差异不显著，表明多数ST239-MRSA-III-t030菌株在同一环境条件下的竞争中存在优势。②将t030与t037菌株过夜培养上清中的蛋白用三氯醋酸沉淀后进行SDS-PAGE分析，发现两者的分泌蛋白存在很大差异，为证实一种菌分泌的蛋白是否对另一种菌的生长产生了抑制作用，我们用培养t030菌株7h或者4h的上清去培养t037,同时用培养t037菌株7h或者4h的上清去培养t030，通过这种交叉抑制实验，结果没有发现MRSA t030与t037菌株之间存在交叉抑制作用，前述ST239-MRSA-III-t030在体外生存竞争的优势并非由于t030分泌了特定的抑制因子抑制了t037菌株生长而引起。 4.体内竞争实验：为检测ST239-MRSA-III-t030是否在体内感染中也有竞争优势，随机抽取2个t030/t037菌株对(CQ29/CQ40，SH08/SH02)，过夜培养后用PBS制备成1×108CFU/ml的菌液，各取50μl混合成菌株对，每对菌株经小鼠尾静脉感染5只Balb/c小鼠，3天后处死动物，取肾脏，制成悬液，稀释后采用铺板计数法检测每只小鼠肾脏中细菌的感染量。结果发现，两个实验菌株对中ST239-MRSA-III-t030菌株在小鼠体内每只肾脏中感染量分别达到了每颗肾脏(9.06±0.40)×106CFU和(9.01±0.42)×106CFU，显著高于ST239-MRSA-III-t037菌株感染肾脏的(3.7±0.80)×106CFU和(4.48±0.69)×106CFU，表明ST239-MRSA-III-t030在小鼠体内也较ST239-MRSA-III-t037有竞争感染优势。 5.耐药决定簇及相关基因表达水平检测：我国流行的MRSA克隆ST239-MRSA-III-t030和ST239-MRSA-III-t037在耐药谱上主要表现在对利福平和复方新诺明耐药性的差异，复方新诺明被我国MRSA感染防治专家委员会推荐为MRSA皮肤和软组织感染以及深部根除性治疗的药物，而利福平的穿透力强，专家建议与穿透力弱或副作用较强的药物，如万古霉素等，联合应用于MRSA感染的根除性治疗或手术的感染预防。①细菌对利福平的耐药主要发生在RNA聚合酶β亚单位(RpoB)的基因突变，本研究对12株ST239-MRSA-III-t030的rpoB基因进行了PCR扩增和测序分析。结果显示所有被测菌株都发生了RpoB L466S和H481N的氨基酸替换突变，使得t030菌株的利福平MIC值达到了512μg/ml甚至1024μg/ml。相对而言，复方新诺明通过干扰细菌的叶酸合成途径，抑制细菌的DNA合成而杀菌，MRSA菌对复方新诺明的耐药机制复杂，本研究对12株ST239-MRSA-III-t037菌株中可能与复方新诺明耐药相关的基因，包括胸腺嘧啶核苷合成酶基因thyA；二氢叶酸还原酶基因dfrA；二氢叶酸合成酶基因dhps进行了全基因的PCR扩增和测序分析，结果在这3个基因中没有任何碱基序列的突变，提示我国MRSA菌对复方新诺明的耐药机制与国外报道的显著不同，需要更多的研究进行探索。②细菌发生耐药性突变往往需要付出更高的适应性代价(fitness cost),但MRSA对利福平的耐药性突变，如RpoB H481N会因另一个位点的突变，如S529L,获得适应性补偿(O’Neill et al.2006)，而且这种RpoB双突变还会通过上调MRSA许多基因的表达来增强菌株的适应性，我们随机对2组(CQ29/CQ40，SH50/SH31)菌株培养至对数生长期的RNAIII基因和α-溶血素基因的表达水平进行荧光定量RT-PCR检测，结果显示这些基因在ST239-MRSA-III-t030中的表达显著高于ST239-MRSA-III-t037。虽本研究暂未检测出ST239-MRSA-III-t037菌株耐复方新诺明的基因突变位点，但12株ST239-MRSA-III-t037中有8株在培养基上显示生长受限，表现为小菌落(small colony varients, SCVs)形态，表明ST239-MRSA-III-t037对复方新诺明的耐药需要付出更高的生存代价，这也许是临床上ST239-MRSA-III-t037逐步被ST239-MRSA-III-t030替代的重要原因。 综上所述，本研究选择我国重庆、上海和广州三个地区分离的ST239-MRSA-III-t030和ST239-MRSA-III-t037菌株进行配对研究，从耐药谱分析、生长曲线测定、体内外竞争实验、交叉抑制实验、耐药决定簇检测及基因表达分析，发现ST239-MRSA-III-t030较ST239-MRSA-III-t037有更强的生存优势，初步阐明了我国ST239-MRSA-III-t030逐步替代ST239-MRSA-III-t037而成为最优势克隆的机制，对深入认识MRSA的感染与流行，以及探索控制日益猖獗的MRSA感染新策略均有重要意义。
【关键词】：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 利福平耐药 复方新诺明耐药 克隆替代
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.11
【目录】：

• 缩略语表4-6
• Abstract6-12
• 摘要12-17
• 第一章 前言17-22
• 1.1 选题缘由17
• 1.2 研究背景17-19
• 1.3 研究意义19
• 1.4 研究内容19-20
• 1.5 研究方法20-22
• 第二章 ST239-MRSA-III-t030/ST239-MRSA-III-t037 菌株生存特性研究22-39
• 2.1 材料与方法23-31
• 2.2 结果31-36
• 2.3 讨论36-39
• 第三章 ST239-MRSA-III-t030 替代 ST239-MRSA-III-t037 的机制探讨39-52
• 3.1 材料和方法40-45
• 3.2 结果45-50
• 3.3 讨论50-52
• 全文总结52-54
• 参考文献54-58
• 文献综述58-73
• 参考文献68-73
• 攻读学位期间发表的文章73-74
• 致谢74-75

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