单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体RL1序列抗凋亡作用的研究及其编码的microRNA的筛选

发布时间：2017-06-16 23:07

  本文关键词：单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体RL1序列抗凋亡作用的研究及其编码的microRNA的筛选，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)是人类疾病常见的病原体，在体内易引起持续潜伏感染,当免疫力低下时,可反复被激活，难以治愈。HSV-2的潜伏感染是生殖器疱疹易复发、难根治的主要原因。潜伏相关转录体(LAT)是HSV在潜伏感染时唯一大量存在且高表达的病毒RNA，LAT在HSV潜伏状态建立、维持和复活中发挥作用。目前有关LAT的作用假说很多，但具体是哪一种作用机制尚不明确。LAT不能编码蛋白质，但是LATs能够编码多个有功能的miRNA，microRNA能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对,引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译,从而对基因进行转录后表达的调控，miRNA可能在潜伏感染中发挥重要作用。在病毒潜伏期间LAT编码的miRNA对其靶基因进行干扰作用，抑制细胞凋亡，使病毒长期潜伏。 为此，本研究以HSV-2333基因组为模板PCR扩增HSV-2LAT RL1序列，构建重组真核表达载体pEGFP-RL1。通过脂质体和电转染两种方法转染将重组子转染进Vero细胞和PC12细胞，G418对重组子进行稳定筛选，确定稳定表达的细胞，研究重组子在Vero细胞GenBank及PC12细胞中的表达及其抗凋亡作用，并利用Real-time PCR的方法确定RL1所编码的microRNA，明确RL1是通过编码microRNA来执行抗凋亡功能的。 首先根据中的LAT RL1序列设计引物，以HSV-2333基因组为模板PCR扩增HSV-2LAT RL1片段，构建重组质粒pEGFP-RL1。 重组质粒转染入Vero细胞和PC12细胞，并通过RT-PCR和荧光显微镜确认LAT RL1序列在Vero细胞和PC12细胞中成功转录和表达。凋亡诱导剂放线菌素D(ActD)诱导建立细胞模型，重组质粒在转染试剂的作用下转染进Vero细胞和PC12细胞，G418对重组子进行抗性筛选，然后通过Hochest33342染色，荧光观察，，JC-1荧光染色从定性的角度确定RL1序列具有抗放线菌素D诱导的Vero细胞和PC12细胞的凋亡作用。 MTT结果表明转染了重组质粒pEGFP-RL1的Vero细胞和PC12细胞经放线菌素D凋亡诱导后细胞活性与未经任何处理的正常对照组相比，差异无统计学意义(P0.05)，但高于放线菌素D诱导凋亡的细胞组及与转染空质粒。pEGFP-C2且放线菌素D诱导凋亡的细胞组，差异具有统计学意义(P0.05)。 流式结果表明，转染重组质粒pEGFP-RL1且经放线菌素D诱导凋亡组与正常对照组凋亡率差异无统计学意义(P0.05),而显著低于放线菌素D诱导凋亡组和转染空质粒pEGFP-C2且经放线菌素D诱导凋亡组，差异显著(P0.05)。 Caspase-3活性检测表明转染重组质粒的细胞组caspase-3活性与正常对照组无显著差异，而明显低于空质粒组差异有统计学意义(P 0.05)。 DNA Ladder重组质粒pEGFP-RL1且经放线菌素D诱导凋亡组与正常对照组未见凋亡条带，放线菌素D诱导凋亡组和转染空质粒pEGFP-C2且经放线菌素D诱导凋亡组出现大小不等的小片段。 ReaL-time PCR显示RL1序列能编码5种microRNA，(miR-H3, miR-H4-3p,miR-H4-5p,miR-H24和miR-H19)，且在Vero细胞和在PC12细胞里面，这5中microRNA的表达量是有差异的，这说明microRNA的表达具有组织特异性。且LAT RL1主要是通过这5种microRNA来执行抗凋亡功能的。 综述以上研究结果表明，HSV-2LAT基因RL1片段具有抗放线菌素D在Vero和PC12细胞中诱导的细胞凋亡的功能。且此功能的发挥主要是通过RL1序列编码的microRNA来发挥的。本实验研究为探究有关HSV-2LAT介导的病毒的潜伏和复发的机制打下一定基础。
【关键词】：单纯疱疹病毒Ⅱ型 潜伏相关转录体 RL1 microRNA 抗凋亡
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373.11
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-14
• 英文缩略词表14-17
• 第一章 绪论17-30
• 1.1 单纯疱疹病毒Ⅱ型简述17-18
• 1.2 HSV 的形态与结构18
• 1.3 HSV-2 基因组结构和基因表达18-20
• 1.3.1 HSV-2 基因组结构18-19
• 1.3.2 HSV-2 的基因表达19-20
• 1.4 单纯疱疹病毒的 LAT 基因20-21
• 1.4.1 LAT 家族20
• 1.4.2 LAT 的开放读码框（ORF）20-21
• 1.4.3 LAT 的启动子21
• 1.5 LAT 基因的作用机制21-27
• 1.5.1 LAT 下调单纯疱疹病毒裂解基因的表达21-22
• 1.5.2 LAT 的抗凋亡作用22-23
• 1.5.3 LAT 抗凋亡作用的区域23
• 1.5.4 LAT 抗凋亡作用的机制23-27
• 1.5.4.1 LAT 通过编码蛋白质介导抗凋亡功能23-24
• 1.5.4.2 潜伏相关转录体（LAT）通过编码 microRNA 执行抗凋亡功能24-27
• 1.6 本课题主要内容及意义27-30
• 1.6.1 本课题的研究意义27-29
• 1.6.2 本课题的研究内容29-30
• 第二章 单纯疱疹病毒Ⅱ型 LAT RL1 真核表达载体的构建30-49
• 2.1 前言30
• 2.2 主要实验材料30-34
• 2.2.1 实验耗材和仪器30-31
• 2.2.2 细胞、病毒株、菌株和质粒31-32
• 2.2.3 主要试剂32
• 2.2.4 溶液和培养基32-34
• 2.3 技术路线34
• 2.4 实验方法34-43
• 2.4.1 复苏非洲绿猴肾细胞34
• 2.4.2 传代非洲绿猴肾细胞34-35
• 2.4.3 冻存非洲绿猴肾细胞35
• 2.4.4 单纯疱疹病毒Ⅱ型培养35
• 2.4.5 提取单纯疱疹病毒基因组 DNA35-37
• 2.4.6 PCR 扩增单纯疱疹病毒Ⅱ型 LAT 基因 RL1 序列的37
• 2.4.7 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物37-38
• 2.4.8 凝胶回收纯化 PCR 产物38-39
• 2.4.9 pEGFP-C2 真核表达质粒的扩增39-41
• 2.4.9.1 大肠杆菌细胞感受态的制备39
• 2.4.9.2 质粒 pEGFP-C2 转化39-40
• 2.4.9.3 提取 pEGFP-C2 质粒40-41
• 2.4.10 pEGFP-C2 空载体和单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2） LAT-RL1 序列的双酶切41
• 2.4.11 双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳验证41
• 2.4.12 回收纯化双酶切的产物41
• 2.4.13 单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）潜伏相关转录体（LAT）RL1 序列和大肠杆菌质粒pEGFP-C2 连接41-42
• 2.4.14 大肠杆菌 Top10 感受态细胞制备42
• 2.4.15 连接产物的转化42
• 2.4.16 阳性菌落 PCR 的初步鉴定42-43
• 2.4.17 重组的真核表达载体大肠杆菌质粒 pEGFP-RL1 的提取43
• 2.4.18 重组的真核表达载体大肠杆菌质粒 pEGFP-RL1 单双酶切鉴定43
• 2.4.19 双酶切目的产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定43
• 2.4.20 重组真核表达载体 pEGFP-RL1 上 RL1 序列的测序鉴定43
• 2.5 结果与讨论43-48
• 2.5.1 Vero 细胞 CPE 病变43-44
• 2.5.2 HSV-2 LAT 基因 RL1 序列的 PCR 扩增44
• 2.5.3 阳性菌落的 PCR 鉴定44-45
• 2.5.4 重组真核表达载体 pEGFP-C2/LAT RL1 的酶切和测序鉴定45
• 2.5.5 重组真核表达载体 pEGFP-RL1 的测序鉴定45-48
• 2.6 小结48-49
• 第三章 单纯疱疹病毒Ⅱ型 LAT 基因 RL1 在真核细胞中的表达及鉴定49-61
• 3.1 前言49
• 3.2 主要实验材料49-51
• 3.2.1 实验仪器和耗材49-50
• 3.2.2 细胞、菌株和质粒50
• 3.2.3 主要试剂50
• 3.2.4 溶液50-51
• 3.3 技术路线51
• 3.4 实验方法51-57
• 3.4.1 小提无内毒素质粒51-52
• 3.4.2 质粒浓度的测定52
• 3.4.3 Vero 细胞的培养52-53
• 3.4.3.1 Vero 细胞的复苏52-53
• 3.4.3.2 Vero 细胞的传代培养53
• 3.4.3.3 Vero 细胞的冻存53
• 3.4.4 PC12 细胞的培养53-54
• 3.4.5 重组质粒转染 Vero 细胞和 PC12 细胞54-55
• 3.4.6 RT-PCR 鉴定 LAT-RL1 转录55-57
• 3.4.6.1 提取 Vero 和 PC12 细胞总的 RNA55-56
• 3.4.6.2 逆转录得到第一链 cDNA56
• 3.4.6.3 以逆转录所得的 cDNA 为模板进行 PCR56-57
• 3.5 结果与讨论57-59
• 3.5.1 Vero 细胞的培养57
• 3.5.2 PC12 细胞的培养57-58
• 3.5.3 质粒在 Vero 和 PC12 细胞中的表达58-59
• 3.5.4 RT-PCR 检测 LAT- RL1 在 Vero 细胞中的表达59
• 3.6 小结59-61
• 第四章 单纯疱疹病毒Ⅱ型LAT-RL1片段对Vero细胞及PC12细胞的抗凋亡作用研究及 miRNA的筛选61-88
• 4.1 前言61
• 4.2 主要实验材料61-65
• 4.2.1 仪器和设备61-62
• 4.2.2 菌株、质粒和细胞62-63
• 4.2.3 主要试剂63
• 4.2.4 溶液63-65
• 4.3 技术路线65
• 4.4 实验方法65-75
• 4.4.1 Vero 细胞及 PC12 细胞的的培养65
• 4.4.2 质粒转染 Vero 和 PC12 细胞65-67
• 4.4.3 G418 对筛选稳定转染的细胞67
• 4.4.4 放线菌素 D(actinomycin D，ACTD)诱导 Vero 细胞及 PC12 细胞凋亡67-68
• 4.4.5 MTT 法检测细胞增殖68
• 4.4.6 流式细胞术检测细胞凋亡68
• 4.4.7 Hoechst33342 荧光染色观察细胞凋亡68-69
• 4.4.8 JC-1 细胞凋亡线粒体膜电位检测69-70
• 4.4.9 DNA ladder 检测细胞凋亡70
• 4.4.10 Caspase 3 凋亡蛋白检测70-71
• 4.4.11 Vero 和 PC12 细胞总蛋白鉴定71-72
• 4.4.11.1 Vero 和 PC12 细胞总蛋白的提取71
• 4.4.11.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶鉴定、分离蛋白质71-72
• 4.4.12 qRT-PCR 检测 HSV-2 LAT RL1 编码的 microRNA72-75
• 4.4.12.1 引物的设计和合成73
• 4.4.12.2 总 RNA 提取73
• 4.4.12.3 逆转录实验73-74
• 4.4.12.4 荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立74
• 4.4.12.5 统计学分析实验结果74-75
• 4.5 结果与讨论75-85
• 4.5.1 质粒 pEGFP-RL1 在 Vero 细胞中及 PC12 细胞中表达的荧光特点75
• 4.5.2 放线菌素 D 诱导 Vero 细胞及 PC12 细胞凋亡模型的建立75-77
• 4.5.3 电转化及 G418 细胞稳定表达筛选77
• 4.5.4 MTT 法测重组质粒对 Vero 细胞及 PC12 细胞活性的影响77-78
• 4.5.5 Hochest 33342 染色观察细胞凋亡78-79
• 4.5.6 JC-1 荧光染色观察细胞凋亡79-80
• 4.5.7 MTT 分析细胞增殖80-81
• 4.5.8 流式细胞仪检测81-82
• 4.5.9 DNA ladder 检测细胞凋亡82-83
• 4.5.10 荧光分光光度计检测 Caspase3 活性83-84
• 4.5.11 SDS-PAGE 检测蛋白的表达84
• 4.5.12 qRT-PCR 检测稳定转染 pEGFP-RL1 的 Vero 细胞及 PC12 细胞中的 microRNA 表达84-85
• 4.6 小结85-88
• 结论与展望88-90
• 结论88
• 本论文的创新之处88
• 展望88-90
• 参考文献90-97
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果97-98
• 致谢98-99
• 附件99

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 ;MIRE: A GRAPHICAL R PACKAGE FOR MICRORNARELATED ANALYSIS[J];Chinese Medical Sciences Journal;2008年04期

2 张坤山;李思光;罗玉萍;;调控过氧化物酶体生物合成和增殖的microRNA的计算机分析[J];细胞生物学杂志;2009年02期

3 许建;武治印;于典科;;血清microRNA在肿瘤诊断和预后评估中的应用[J];科学通报;2010年01期

4 王羽欧;桑伟伟;张红胜;;microRNA在人类免疫缺陷病毒感染中的作用[J];生物技术通讯;2011年01期

5 王梓;李善妮;刘静;;microRNA在急性淋巴细胞白血病中的作用[J];生命科学研究;2012年02期

6 姜彬;;microRNA及其与衰老进程的关系[J];生物学通报;2012年01期

7 罗海涛;赵屹;;microRNA的功能(英文)[J];生物化学与生物物理进展;2012年10期

8 朱耀魁;程妮;张磊;岑颖洲;;microRNA-181家族与疾病的相关性研究进展[J];暨南大学学报(自然科学与医学版);2012年06期

9 焦晶凯;莫蓓红;高红艳;;microRNA功能研究新进展[J];中国畜牧兽医;2013年02期

10 罗金;刘光远;袁小松;王芳芳;田占成;谢俊仁;王辉;;microRNA碱基编辑特性的研究进展[J];中国兽医科学;2013年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 贾新正;卢肖男;聂庆华;张细权;;鸡部分microRNA的同源预测与克隆验证[A];中国动物遗传育种研究进展——第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集[C];2009年

2 李炯;段德民;郑克孝;;新型非标记高通量microRNA芯片技术[A];第一届全国生物物理化学会议暨生物物理化学发展战略研讨会论文摘要集[C];2010年

3 徐晨;鲍坚强;李定;郭强苏;;microRNA-449在小鼠精子发生过程中的作用研究[A];中国解剖学会2011年年会论文文摘汇编[C];2011年

4 李道传;王庆;杨萍;唐石伏;李志芳;肖勇梅;魏青;张波;陈雯;;microRNA在细胞转化中的表达差异[A];中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会第六届全国学术会议、中国毒理学会遗传毒理专业委员会第五届全国学术会议、广东省预防医学会卫生毒理专业委员会学术会议、广东省环境诱变剂学会学术会议论文汇编[C];2008年

5 ;Induced cardiac myocytes apoptosis in vitro by micro RNA-122 overexpression[A];第十三次全国心血管病学术会议论文集[C];2011年

6 罗维;林宇翔;绳纪坡;于芳;胡宝成;;靶向细胞外基质磷酸糖蛋白的microRNA的筛选及鉴定[A];第二届模式生物与人类健康研讨会会议论文集[C];2012年

7 ;microRNA-19a,a Novel Prognosis Predictor of Hepatocellular Carcinoma Following Liver Transplantation,Suppresses Cancer Metastasis by Down-Regulating SOX4[A];2012中国器官移植大会论文汇编[C];2012年

8 任雪峰;Dan GAILE;宫志宏;葛怡琛;黄陈平;闫洪涛;邬红梅;;砷对大鼠肝microRNA表达的影响[A];中国毒理学会第六届全国毒理学大会论文摘要[C];2013年

9 刘咏梅;王阶;;心血管疾病相关microRNA的研究进展[A];第十次中国中西医结合学会心血管病学术大会暨第五次江西省中西医结合学会心血管病学术大会论文汇编[C];2010年

10 巩丽颖;孙开来;;两种microRNA在先心病心肌组织中的表达[A];中国的遗传学研究——遗传学进步推动中国西部经济与社会发展——2011年中国遗传学会大会论文摘要汇编[C];2011年

中国重要报纸全文数据库 前4条

1 陈英云 乔蕤琳;哈医大成功研发国内首例microRNA转基因及敲减小鼠模型[N];黑龙江经济报;2010年

2 记者 陈青;2厘米以下肝癌检出率88%[N];文汇报;2011年

3 特约记者 肖鑫　记者 唐先武;我科学家提出肝癌预防判断与治疗新的潜在靶标[N];科技日报;2011年

4 记者 顾泳;一毫升血诊断早期小肝癌[N];解放日报;2011年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 杨军;软骨分化过程中的microRNA的功能研究[D];上海交通大学;2011年

2 朱丹霞;microRNA在慢性淋巴细胞白血病凋亡抑制通路中的作用研究[D];南京医科大学;2012年

3 高雪;血浆microRNA作为肝癌及慢性乙肝肝损伤分子标记物的研究[D];复旦大学;2012年

4 鲍习琛;MicroRNA-302-367簇促进体细胞重编程和microRNA-145抑制肺癌细胞增殖的研究[D];中国科学技术大学;2011年

5 蒋婷婷;microRNA在肿瘤发生发展过程中的异常表达及其功能研究[D];浙江大学;2012年

6 阮灵伟;深海热液区管状蠕虫的分子特征及对虾microRNA的初探[D];厦门大学;2009年

7 徐凤丹;microRNA基因表达调控网络的动力学与功能研究[D];上海大学;2010年

8 杨云娇;microRNA作为原发性胆汁性肝硬化新的疾病标志物及其功能的初步研究[D];北京协和医学院;2013年

9 颜兴起;MicroRNA功能的生物信息学分析及相关平台的建立[D];中国协和医科大学;2008年

10 付极;microRNA-451对胰腺癌细胞化疗敏感性的影响[D];北京协和医学院;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 陈旭;玉米microRNA的计算机预测与克隆及在干旱下的差异表达分析[D];四川农业大学;2009年

2 史菊;基于qRT-PCR检测ESCC组织/血清microRNA的方法建立及其应用的研究[D];苏州大学;2012年

3 朱小舟;microRNA在胚胎血发生中的功能及调控研究[D];华东师范大学;2011年

4 庞鑫;microRNA分离制备方法的研究[D];兰州大学;2012年

5 范心廷;鉴别三种肺癌亚型的microRNA数学模型在支气管刷检样本中的验证[D];复旦大学;2012年

6 何沉峰;一种基于能量和结构的microRNA成熟体预测方法[D];南京大学;2011年

7 周冬根;犬类microRNA的计算机鉴定及分析[D];南昌大学;2007年

8 李世风;马铃薯microRNA及其靶基因的预测与功能分析[D];甘肃农业大学;2010年

9 刘晓玲;基于等温放大反应检测microRNA[D];河北大学;2013年

10 边黎颖;水稻microRNA过表达转化植株的获得及表型与功能分析[D];扬州大学;2010年

  本文关键词：单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体RL1序列抗凋亡作用的研究及其编码的microRNA的筛选，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：456682