埃莎霉素产生菌的分子育种及其分类的初步鉴定

发布时间：2017-06-25 14:09

  本文关键词：埃莎霉素产生菌的分子育种及其分类的初步鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：必特螺旋霉素(BT)是利用基因工程技术,将来源于耐热链霉菌的异戊酰基转移酶基因(ist)克隆至螺旋霉素产生菌染色体,所获得的基因工程菌的发酵产物,目前BT已完成临床试验研究,进入新药生产注册申报阶段,必特螺旋霉素是个多组分抗生素,是以异戊酰螺旋霉素(简称埃莎霉素)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个组分为主成分,还含有其他酰化螺旋霉素的小组分。研究表明,BT与埃莎霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个单组分的抗菌活性没有显著差异。因此,埃莎霉素的单一组分可能与BT多组分具有同样的抗菌效果。构建埃莎霉素霉素单组分(IA-Ⅰ)产生菌对简化生产工艺、质量控制及制剂改良均有重要的社会和经济意义。本实验室利用基因阻断技术,已构建了只产生埃莎霉素Ⅰ组分的菌种WSJ-2。但是,该菌种发酵单位很低,不利于进行规模化生产。 已知来源于碳霉素(16元大环内酯抗生素)产生菌耐热链霉菌的异戊酰基转移酶基因ist与调节基因acyB2连锁,调节基因的存在可以激活ist基因的表达；只有含有完整ist和acyB2调节基因才能在变铅青链霉菌表达ist的活性,但是,迄今为止没有异源转入ist和acyB2基因可以直接提高抗生素产量或单组分含量的报道。本研究的目的是利用ist-acyB2连锁基因,同时采用基因稳定整合表达系统,对WSJ-2实施分子育种,以提高产生菌埃莎霉素Ⅰ组分的含量及产量。 我们首先构建了含有4”-异戊酰基转移酶基因ist和耐热链霉菌调节基因acyB2连锁片段的重组质粒pSET152-ia,然后将其导入到埃莎霉素Ⅰ产生菌WSJ-2中,通过pSET152载体上attp附着位点整合到WSJ-2的染色体上,获得了新的埃莎霉素Ⅰ组分产生菌WSJ-IA。在一定发酵条件下,WSJ-IA发酵产量比原株WSJ-2提高4.14倍,产生埃莎霉素Ⅰ组分含量比原株提高3.47倍。所获得的新的埃莎霉素Ⅰ组分产生菌WSJ-IA在不加药条件下连续传代,抗性表达稳定,其发酵产量及组分含量基本稳定。本研究结果表明,耐热链霉菌ist-acyB2连锁基因可以明显提高埃莎霉素Ⅰ的组分含量和发酵产量,同时,所获得的WSJ-IA产生菌在为今后将BT开发为单组分有效新抗生素中的应用及探讨ist外源基因在螺旋霉素宿主菌中的调控机制奠定基础。 必特螺旋霉素(BT,原名生技霉素)是利用基因工程技术研制的以4”位异戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、为主要成分的酰化螺旋霉素。埃莎霉素(异戊酰螺旋霉素)Ⅰ是在BT基础上利用基因工程技术创制的BT中单一组分的抗生素。 本研究第一部分利用调节基因acyB2激活异戊酰基转移酶(ist)基因表达的特点,将ist与调节基因acyB2连锁导入埃莎霉素Ⅰ产生菌,获得埃莎霉素Ⅰ单组分的高含量及高产量菌株WSJ-IA。由于WSJ-IA在今后开发为单组分有效新抗生素中具明显的潜在能力。BT及埃莎霉素Ⅰ产生菌在构建中经过多次染色体基因工程及诱变改造,为了考察菌种的遗传稳定性,并在今后生产中有效地保护生产菌种,有必要对它及其出发菌株-螺旋霉素产生菌在分类中的地位给予确定。 链霉菌分类学研究是当今的研究热点,近年以链霉菌种属16S rRNA序列保守性作为分子分类学标志的研究发展迅速,但是,已证明仅用16S rRNA序列作为分类标志,许多种属之间的关系仍然不清楚,因此,选用多个看家基因保守序列作为分子标志,可以比较清楚的确定链霉菌的种属地位。 本研究对WSJ-IA及BT原株-螺旋霉素产生菌Streptomyces spiramyceticus F21进行了初步鉴定。从形态学、培养和生理生化特征、细胞壁化学组成、16S rRNA基因序列、5个看家基因(atpD、gyrB、rpoB、recA和trpB)蛋白分析和系统发育树构建等方面对该菌株及其原株进行了鉴定。结果表明两株菌在形态培养特征、生理生化特征、细胞壁化学组成、16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白水平基本一致,在系统发育树分析中同处在一个分支中。而在16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白水平在系统发育上它们均与已知相近菌株处于不同的分支上,并且不同基因与之相近菌株各有不同,相似菌株中无一报道产生螺旋霉素。说明Streptomyces spiramyceticus F21可能是一个产生螺旋霉素的链霉菌新种,16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白序列分析可以作为埃莎霉素Ⅰ基因工程菌生产过程中进行鉴别的分子标志。同时,本研究为在长期大规模生产中应用分子标志考察链霉菌基因工程菌株的遗传稳定性提供了依据。
【关键词】：埃莎霉素Ⅰ产生菌 4”-异戊酰基转移酶基因(ist) 调节基因acyB2 埃莎霉素(异戊酰螺旋霉素)Ⅰ Streptomyces spiramyceticus F21 16S rRNA基因 多相分类
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
【目录】：

• 第一部分 利用调节基因进行必特螺旋霉素单组分(埃莎霉素)产生菌的分子育种7-42
• 中文摘要7-8
• Abstract8-10
• 前言10-16
• 1 必特螺旋霉素概述10-11
• 2 基因工程育种抗生素产生菌研究进展11-14
• 3 本论文研究目的和意义14
• 4 论文研究内容和技术路线14-16
• 实验材料16-20
• 1. 生物信息学分析工具16
• 2. 菌种16
• 3. 基因和载体16
• 4. 试剂与工具酶16-17
• 5. 实验仪器17-18
• 6. 培养基18-19
• 7. 常用缓冲液19-20
• 实验方法20-27
• 1. E.coli质粒DNA小量提取20-21
• 2. E.coli质粒DNA大量提取21
• 3. 限制酶切反应21
• 4. DNA电泳及片段回收21
• 5. DNA连接反应21
• 6. E.coli DH5α感受态细胞的制备21-22
• 7. 质粒DNA转化E.coli DH5α感受态细胞22
• 8. E.coli转化子的验证22
• 9. 链霉菌原生质体的制备、再生及DNA转化原生质体22-23
• 10. 链霉菌总DNA提取方法23
• 11. 少量快速提取链霉菌总DNA23-24
• 12. PCR反应24-25
• 13. 测序25
• 14. 菌株筛选、发酵及发酵液的提取25
• 15. 抗生素生物效价测定25-26
• 16. 高效液相色谱分析26-27
• 实验结果与讨论27-41
• 1. 含ist-acyB2连锁基因重组质粒pSETl52-ia的构建27-32
• 2. E.coli ET 12567/PUZ8002(pSET152-ia)阳性转化子的筛选和鉴定32-33
• 3. acyB2基因整合型工程菌WSJ-IA的筛选和鉴定33-34
• 4. WSJ-IA菌种发酵产生埃莎霉素Ⅰ组分的检测34-36
• 5. WSJ-IA遗传稳定性实验36-38
• 讨论38-41
• 小结41-42
• 第二部分 基因工程埃莎霉素Ⅰ产生菌以及出发菌株-螺旋霉素产生菌分类的初步鉴定42-82
• 中文摘要42-43
• Abstract43-45
• 前言45-52
• 1. 必特螺旋霉素单组分-埃莎霉素Ⅰ概述45-46
• 2. 放线菌分类学研究进展46-50
• 3. 本论文的研究目的和意义50
• 4. 论文的研究内容和技术路线50-52
• 实验材料52-54
• 1. 生物信息学分析工具52
• 2. 菌种来源52
• 3. 主要试剂52
• 4. 主要仪器52
• 5. 培养基52-54
• 实验方法54-60
• 1. 菌株的形态和培养特征观察54
• 2. 菌株生理生化特征测定54-55
• 3. 菌株细胞壁化学组成分析55-56
• 4. 基于菌株16SrRNA基因序列的系统发育分析56-58
• 5. 基于菌株看家基因蛋白序列的系统发育分析58-60
• 实验结果与讨论60-81
• 1. 菌株的形态和培养特征观察结果60
• 2. 生理生化特征实验结果60-62
• 3. 细胞壁化学成分分析62
• 4. 基于菌株16S rRNA基因序列的系统发育分析62-67
• 5. 基于菌株看家基因部分序列和蛋白序列的系统发育分析67-79
• 讨论79-81
• 小结81-82
• 参考文献82-89
• 综述89-104
• 参考文献99-104
• 英文缩略语104-106
• 附录106-111
• 致谢111

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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8 刘垂s

本文编号：482382