利用TALEN双修饰敲除位于AT-丰富区脆性位点基因FATS的小鼠模型研究

发布时间：2017-09-25 23:30

  本文关键词：利用TALEN双修饰敲除位于AT-丰富区脆性位点基因FATS的小鼠模型研究

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【摘要】：目的 转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)作为一种新的基因修饰方法,自2011年以来成功应用于基因修饰以及动物模型的产生。FATS基因属于脆性位点基因,其编码序列位于基因组中AT富含区,特别是其有重要功能的最大外显子被含有重复序列的大片段AT富含区所包围,难以用常规胚胎干细胞同源重组方法实现定位敲除。为了建立FATS基因敲除小鼠模型,我们通过构建’TALEN打靶载体,并创新性地用TALEN双修饰法进行FATS基因敲除,探索高效建立基因敲除小鼠模型的新途径。 方法 1.采用生物信息学方法分析小鼠的FATS基因的编码序列,确定打靶载体的设计位点。针对其最大外显子部位设计两对TALEN载体,确保打靶成功率。 2.一采用Golden Gate的方法组装TALEN打靶载体,载体组装完成后通过PCR和测序验证打靶载体是否正确,将序列正确的克隆进行质粒DNA提取和纯化。 3.将FATS-TALEN打靶质粒DNA通过电穿孔方法转染小鼠HC11细胞,72小时后提取细胞基因组DNA,进行T7E1酶切实验,并通过T-A克隆测序验证FATS-TALEN打靶载体在细胞水平上的体外切割效率。 4.体外鉴定FATS-TALEN载体有效后,将打靶载体DNA酶切线性化,通过T7转录试剂盒体外转录成具有5’帽子和3'polyA尾巴的成熟mRNA。对小鼠单细胞期受精卵进行原核注射,注射后的受精卵移植到假孕母鼠体内。 5.待小鼠出生后,剪脚趾编号进行基因鉴定,确定阳性小鼠(FO, founder)。同时检测FATS-TALEN打靶载体在这些F0小鼠中是否有打靶非特异性(off-target)情况。 6.将阳性小鼠和野生型小鼠交配,得到杂合的F1代小鼠,F1代小鼠自交得到纯合的FATS基因敲除小鼠。 7.分别取一月龄的野生型小鼠、杂合小鼠、纯合小鼠睾丸提取蛋白质裂解液,通过Western blot检测FATS蛋白的表达情况。 结果 1.细胞实验结果证实,设计的两对TALEN都具有双链切割活性,通过TA克隆证实两对TALEN打靶载体的体外效率分别为25%和4.5%。 2.两对TALEN打靶载体的体内致突变效率分别为17.2%和14.3%。在单对FATS-TALEN mRNA浓度不变的情况下,两对FATS-TALEN打靶载体同时注射到单细胞期的小鼠受精卵中,可以将阳性founder小鼠的比例增加到61.5%。并且通过两对TALEN的同时切割,实现了TALEN介导的染色体DNA长片段的缺失。 3.T7E1酶切实验和测序结果证明TALEN具有很好的特异性和专一性,通过对全基因组相似序列的检测,没有检测到off-target现象。 4.由TALEN引起的基因敲除可以通过生殖细胞传给下一代小鼠。 5.通过Western blot实验证明在杂合基因敲除的小鼠体内,FATS基因的蛋白表达水平降低；在纯合基因敲除的小鼠体内,FATS基因的蛋白表达沉默。 结论 1.在每对FATS-TALEN mRNA浓度不变的情况下,两对TALEN同时注射可以显著提高阳性小鼠的比率,同时可以造成长片段的缺失突变,方便PCR快速鉴定。 2. TALEN打靶载体具有很好的特异性,并且由TALEN引起的突变可由生殖细胞传给F1代小鼠。因此,TALEN双修饰技术进一步增强TALEN单修饰技术建立基因敲除模型的有效性和实用性,对脆性位点基因功能的系统性研究有深远的促进作用。
【关键词】：普通型脆性位点 TALEN 移码突变 基因敲除
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416;R-332
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语10-11
• 前言11-13
• 研究现状、成果11-12
• 研究目的、方法12-13
• 对象和方法13-27
• 1.1 实验材料13-17
• 1.1.1 菌株、质粒和细胞系13
• 1.1.2 主要试剂及配制13-16
• 1.1.3 主要仪器设备16-17
• 1.2 实验方法17-27
• 1.2.1 打靶载体质粒的构建17-19
• 1.2.2 TALEN打靶载体体外效率的验19-21
• 1.2.3 mRNA的体外转录21-23
• 1.2.4 T7EN1实验及TA克隆23-24
• 1.2.5 RT-PCR24-25
• 1.2.6 Western Blot实验25-27
• 结果27-38
• 2.1 打靶载体的组装和体外效率的验证27-29
• 2.2 打靶载体的体外转录和knockout小鼠的鉴定29-34
• 2.3 Founder小鼠的off-target检测和传代34-37
• 2.4 FATS蛋白在蛋白水平上表达的检测37-38
• 讨论38-41
• 结论41-42
• 参考文献42-45
• 发表论文和参加科研情况说明45-46
• 综述 翻译起始因子eIF4E的分子功能与研究进展46-63
• 综述参考文献57-63
• 致谢63

【共引文献】

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本文编号：920242