β-catenin基因对脊髓源性神经干细胞增殖及分化作用的研究

发布时间：2018-01-24 03:49

  本文关键词： β-catenin 脊髓源性神经干细胞 增殖 分化　出处：《重庆医科大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的从CD1胎鼠脊髓中提取神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)并对细胞进行鉴定,探讨β-catenin基因对脊髓源性神经干细胞的作用,为进一步体内试验提供理论基础。方法将E14的CD1孕鼠麻醉后取出胎鼠,无菌条件下分离胎鼠脊髓组织,单细胞克隆技术及干细胞培养技术对分离的细胞进行扩增培养,细胞免疫荧光技术对细胞进行鉴定;实验分为三组:Blank组(无外加条件培养的神经干细胞),GFP组(感染Ad-GFP腺病毒的神经干细胞),β-catenin组(感染Ad-β-catenin腺病毒的神经干细胞),感染病毒时间均为5d。光学显微镜观察三组细胞的形态学,荧光显微镜观察病毒的感染效率,流式细胞技术对感染效率进行验证,Western blot检测三组细胞β-catenin蛋白的表达情况;CCK8检测和结晶紫染色法检测三组细胞的数量,台盼蓝染色法检测β-catenin作用于NSCs后细胞的存活率;RT-PCR检测三组细胞的神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的m RNA表达,免疫荧光检测神经细胞核(Neu N)、GFAP的表达及定位;Western blot检测Neu N、GFAP的蛋白表达情况。结果胎鼠脊髓组织中分离出的细胞具有极强的克隆能力,可以形成细胞团,机械分离后细胞贴壁,呈不规则球形,免疫荧光结果提示早期分离的大部分细胞Nestin抗原呈阳性;感染Ad-β-catenin腺病毒5d后,细胞形态发生变化,其突触增长,细胞变小,突触之间连接增多,细胞折光性增强;荧光显微镜观察及流式细胞技术结果显示感染病毒3d时细胞的病毒感染率在50%左右,5d时感染率在80%左右,Western blot结果证实感染5d时β-catenin组的β-catenin蛋白表达明显高于其他两组(P0.05);CCK8及结晶紫染色结果示β-catenin组的细胞数量明显高于Blank组及GFP组(P0.05),台盼蓝染色检测发现β-catenin组的细胞存活率也明显高于其他两组(P0.05);PCR结果显性神经细胞标志物NSE的m RNA在β-catenin组显著高于Blank组及GFP组,而胶质细胞标志物GFAP的m RNA表达均低于其他两组(P0.05);免疫荧光结果显示β-catenin组Neu N蛋白的表达显著高于其余两组(P0.05),主要定位于细胞核中,GFAP的表达相对较低(P0.05);Western blot结果显示β-catenin组的Neu N蛋白表达显著高于Blank组及GFP组,而GFAP蛋白表达低于其他两组(P0.05)。结论胎鼠脊髓组织中分离获得的细胞可克隆成神经球,是具有自我复制及多向分化能力的脊髓源性NSCs;腺病毒可作为载体将β-catenin转入NSCs中,感染效率高;β-catenin可促进脊髓源性NSCs的增殖,并且提高细胞的存活率,使其向神经元分化。
[Abstract]:Objective To study the effect of 尾 - catenin on the expression of 尾 - catenin in rat spinal cord . The expression of 尾 - catenin was detected by Western blot . The results showed that the expression of 尾 - catenin was significantly higher than that in the other two groups ( P0.05 ) . The results showed that the expression of Neu N protein in rat spinal cord tissue was significantly higher than that in the other two groups ( P0.05 ) . The results showed that the expression of Neu N protein was significantly higher than that in the other two groups ( P0.05 ) .

【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R651.2

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本文编号：1459094