体外共培养条件下定向诱导人羊膜间充质干细胞向人前交叉韧带成纤维细胞分化的实验研究

发布时间：2018-03-17 15:50

本文选题：人羊膜间充质干细胞　切入点：人前交叉韧带成纤维细胞　出处：《遵义医学院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:1)探讨人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs)是否具有MSCs的特性及纯度。2)比较胶原酶消化法与原位组织块培养法对分离人前交叉韧带成纤维细胞(human anterior cruciate ligament fibroblasts,h ACLFs)的效果;探讨使用碱性成纤维生长因子(fibroblast growth factor,FGF)作用于人前交叉韧带成纤维细胞后细胞形态学改变、增殖及相关基因和蛋白表达的效应。3)探讨体外联合生长因子行单纯诱导、单层共培养及Transwell共培养定向诱导人羊膜间充质干细胞向人前交叉韧带成纤维细胞分化的效果。方法:1)取产妇胎盘用胰酶-胶原酶联合消化法分离获得h AMSCs。流式细胞术分析鉴定h AMSCs表型分子,CCK-8法检测h AMSCs增殖活性,免疫荧光染色检测第3代h AMSCs的CK-19和波形蛋白表达。分别使用茜素红、甲苯胺蓝及油红O染色法检测7d和21d时h AMSCs向成骨、成软骨及成脂细胞分化后的效果。对成骨细胞行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测。实时荧光定量PCR检测向成骨、成软骨及成脂细胞诱导7d、21d时相关基因表达水平。2)分别使用胶原酶消化法和组织块原位培养法分离h ACLFs,倒置相差显微镜观察两种方法分离的细胞形态,CCK-8法检测两种分离方法细胞增殖能力;流式细胞术检测h ACLFs细胞表型;使用b FGF培养第3代h ACLFs后,倒置相差显微镜观察细胞形态、CCK-8法检测细胞增殖活性,分别在第7d、10d及14d时行免疫荧光染色观察细胞I、III型胶原,纤维连接蛋白(Fibronectin)及细胞连接素(Tenascin-C)的表达,实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹试验(Western blot)检测韧带相关基因及蛋白水平改变。3)联合应用转化生长因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)和b FGF作为诱导剂置于LG-DMEM/F12培养基中。使用第3代h AMSCs和h ACLFs,按照单纯诱导、单层共培养及Transwell共培养进行分组:单纯诱导组(A组)、单纯非诱导组(B组)、单层共培养诱导组(C组)、单层共培养非诱导组(D组)、Transwell共培养诱导组(E组)及Transwell共培养非诱导组(F组)。共培养组两种细胞密度调整为104/ml比例为1:1,其中C、D两组中的h ACLFs在共培养前24h内使用Arab-C(终浓度为5μg/ml)以特异性杀灭处于S期的成纤维细胞。倒置相差显微镜观察各组细胞形态。CCK-8法检测各组细胞的增殖活性,分别于7d、14d和21d时:免疫荧光染色观察各组细胞I、III型胶原,Fibronectin及Tenascin-C的表达情况,实时荧光定量PCR法检测各组韧带相关基因表达水平,苦味酸天狼猩红染色法观察各组细胞总胶原表达,Western blot检测各组细胞中韧带相关蛋白的表达。结果:1)胰酶-胶原酶联合消化法可获得大量可稳定增殖的h AMSCs。流式细胞术鉴定结果表明h AMSCs表达MSCs表型。第3代h AMSCs高表达波形蛋白,低表达CK-19。茜素红染色显示,成骨诱导后细胞存在多个矿化结节,细胞中碱性磷酸酶活性明显增加;甲苯胺蓝染色显示,成软骨诱导后细胞基质中分泌大量的糖胺聚糖;油红O染色显示,成脂诱导后,细胞浆内可见脂滴。实时荧光PCR结果显示,成骨、成软骨及成脂诱导21d后,相关基因表达较7d时明显增高(P0.05)。2)流式细胞术结果显示体外分离的h ACLFs表达成纤维细胞相关表型分子。使用两种分离方法分离的细胞形态学在传至第2代时发生改变,组织块原位培养法分离的细胞数量更多,呈长梭形、双极样生长,形态更加趋近于成纤维细胞,胶原酶消化法分离的细胞数量较少,呈短棒、不规则状。组织块原位培养法分离的h ACLFs增殖能力显著高于胶原酶消化法(P0.05)。b FGF作用于第3代h ACLFs后,细胞增殖能力显著提高(P0.05),细胞呈长梭形、成纤维样生长且极性明显。免疫荧光染色显示使用b FGF培养的细胞其I、III型胶原,Fibeonectin和Tenascin-C表达有显著提高;PCR结果显示b FGF培养组中I、III型胶原、Fibronectin、Tenascin-C,基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、赖氨酰氧化酶-1(lysyl oxidase-1,LOX-1)的m RNA表达水平显著上调(P0.05)。Western blot结果显示加入b FGF培养的h ACLFs其I、III型胶原蛋白表达水平显著高于对照组(P0.05)。3)使用诱导因子的各组其细胞增殖水平显著高于未使用诱导因子组(P0.05)。免疫荧光染色显示I、III型胶原,Fibeonectin和Tenascin-C表达水平随时间延长而增加,使用诱导因子各组蛋白表达水平高于非诱导组,其中Transwell共培养诱导组于21d时蛋白表达较其他组更高。PCR结果显示I、III型胶原、Fibronectin、Tenascin-C,MMP-2、LOX-1、α-肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的m RNA表达水平于14d和21d时显著上调(P0.05),Transwell共培养诱导组于21d时,I、III型胶原、MMP-2、LOX-1、α-SMA其表达高于其他组。Western blot结果显示Transwell共培养诱导组于21d时I、III型胶原蛋白表达水平显著高于其他组(P0.05)。苦味酸天狼猩红染色结果显示21d时Transwell共培养诱导组总胶原水平最高,较其他组有统计学意义(P0.05)。结论:1)人羊膜间充质干细胞具有MSCs的特征并且可以向成骨细胞,软骨细胞及脂肪细胞的潜能,可选作为组织工程学的种子细胞。2)体外成功分离h ACLFs,并表达成纤维细胞的表型分子;证实组织块原位培养法分离的细胞增殖效率更高,获得细胞数量更多,形态学更趋近于成纤维细胞。3)b FGF可提高h ACLFs体外增殖能力,细胞形态更趋向成纤维细胞特性,韧带相关特异性基因及蛋白表达增加。4)b FGF联合TGFβ-1可促进h AMSCs向h ACLFS分化;单层共培养与Transwell共培养较单纯诱导方法,细胞分化效果更加明显;在基因、蛋白及胶原分泌水平上,Transwell共培养方式比单层共培养诱导效果更强,且Transwell共培养方式诱导的细胞与正常水平的h ACLFs更为趋近;Transwell共培养可更好的模拟体内环境,联合使用b FGF和TGFβ-1可提高h AMSCs向h ACLFs分化效率及诱导效果。Transwell共培养与生长因子的联合应用为构建组织工程化韧带提供了新的方法。
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【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R687.4

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