血管紧张素-Ⅱ预处理的人脐带间充质干细胞促进皮肤全层组织缺损性创面愈合的机制研究

发布时间：2018-03-27 17:12

  本文选题：人脐带间充质干细胞　切入点：血管紧张素Ⅱ　出处：《天津医科大学》2016年硕士论文

【摘要】：目的:人脐带间充质干细胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,h UCMSCs)作为一种较新型的MSCs,其移植对于各类损伤的组织器官有良好的修复作用,因此也成为干细胞研究领域的热点之一。但研究发现,h UCMSCs移植后会受到机体内环境的影响,生物学特性发生改变,进而影响其修复效果。那么,如何能够处理h UCMSCs,使其更适应机体内环境,发挥更好的组织修复作用是近来的研究热点,也是本研究的重点。损伤组织局部微环境中RAS系统的激活致使血管紧张素-Ⅱ(Angiotensin-Ⅱ,Ang-Ⅱ)持续生成,影响着内、外源性MSCs的生物学活性及功能。有研究表明,高浓度Ang-Ⅱ可诱导MSCs、人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelia cells,HUVEC)等多种细胞发生损伤、凋亡、甚至死亡,而低浓度Ang-Ⅱ预处理MSCs后,则可显著提高其耐缺氧能力,促进多种细胞因子的分泌。在旁分泌的多种细胞因子中,血管内皮细胞因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是含量较高且发挥修复治疗作用的关键因子,其通过与特异性受体(VEGFR2)结合,激活下游信号而发挥抗细胞凋亡、促细胞增殖以及新生血管生成的作用,进而修复重建各类损伤的组织器官。在前期实验和查阅文献的基础上,本研究拟通过使用适宜浓度Ang-Ⅱ预处理体外培养的h UCMSCs,再将预处理后的h UCMSCs(Ang-Ⅱ-MSCs)移植于全层皮肤缺损动物模型,观察其对创面修复重建的效果,以及深入研究Ang-Ⅱ-MSCs促创面愈合的机制。从而为干细胞用于临床治疗多种创面提供的研究基础。方法:(1)Ang-Ⅱ对h UCMSCs生物学特性的影响:将培养的h UCMSCs随机分为4组:0ng/m L Ang-Ⅱ组(A组)、100ng/m L Ang-Ⅱ组(B组)、500ng/m L Ang-Ⅱ组(C组)和1000ng/m L Ang-Ⅱ组(D组)。倒置相差显微镜观察细胞的形态和生长融合的情况;CCK8法检测细胞的增殖情况;AO-EB染色法检测细胞的凋亡情况;流式细胞仪检测细胞的增殖周期和细胞的凋亡率。ELISA检测上清液中VEGF、b FGF和HGF的含量。(2)Ang-Ⅱ预处理的h UCMSCs(Ang-Ⅱ-MSCs)促进创面愈合的初步探索:实验分为3组:将18-20kg雄性巴马小型猪背部切取三个5cm×5cm大小的正方形的创面,制备全层皮肤组织缺损模型。选取创面的9个点,通过局部注射的方式分别含有Ang-Ⅱ-MSCs(1×107/1 m L ECM)、MSCs(1×107/1 m L ECM)Control(1m L ECM)的1ml培养基注入相应全层皮肤缺损模型创面。Image Pro Plus软件评估各组创面的愈合率,记录创面的愈合时间。组织化学染色检测各组创面组织的整体结构、新生微血管的数量、胶原的排列情况以及角质蛋白K19(CK19)的表达情况。(3)Ang-Ⅱ预处理后h UCMSCs的上清液(Ang-Ⅱ-CM)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、凋亡及血管形成的影响机制研究:首先将培养的HUVEC分为3组:培养基组(CM)、MSCs条件培养基组(MSCs-CM)、100ng/m L Ang-Ⅱ预处理后MSCs条件培养基组(Ang-Ⅱ-CM),研究Ang-Ⅱ-CM对HUVEC的增殖、凋亡的影响。选用1000ng/m L Ang-Ⅱ致HUVEC损伤,制备凋亡模型。倒置相差显微镜观察各组细胞的形态;CCK8法检测各组细胞的增殖情况;AO-EB、Hoechst染色法、流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况;Western Blot检测各组细胞Caspase-3、bcl-2的表达情况,体外血管生成实验检测各组细胞血管形成能力。在Ang-Ⅱ-CM对HUVEC的增殖、凋亡影响研究结果的基础上,深入探讨h UCMSCs旁分泌的VEGF对HUVEC的保护机制,本实验继续分为以下6组:si RNA-Control+CM、si RNA-Control+MSCs-CM、si RNA-Control+Ang-Ⅱ-CM、si VEGFR2+CM、si VEGFR2+MSCs-CM、si VEGFR2+Ang-Ⅱ-CM。流式细胞仪检测细胞的凋亡率;Western Blot检测Caspase-3、bcl-2的表达情况;体外血管生成实验检测细胞的血管形成情况。结果:(1)Ang-Ⅱ对h UCMSCs生物学特性的影响:与0 ng/m L组相比,500 ng/m L组和1000 ng/m L组中h UCMSCs的形态结构均发生改变,凋亡细胞的数目较多,增殖活性较低,上清中细胞因子水平也均较低,且1000 ng/m L组最为显著。而100ng/m L组h UCMSCs形态和结构均正常,未见凋亡细胞或死亡细胞,且100ng/m L组细胞的增殖活性和分泌的细胞因子均显著高于0 ng/m L组、500 ng/m L组和1000 ng/m L组。因此,我们筛选100ng/m L Ang-Ⅱ进行预处理h UCMSCs。(2)Ang-Ⅱ预处理的h UCMSCs(Ang-Ⅱ-MSCs)促进创面愈合的初步探索:在Control组、MSCs组和Ang-Ⅱ-MSCs组中,Control组创面的愈合效果最差,Ang-Ⅱ-MSCs组最好。三组创面的愈合时间分别为:55±3d、47±3d和40±3d,Ang-Ⅱ-MSCs组创面的愈合时间最短。在35d时,三组创面的愈合率分别为(63±4)%、(75±4)%和(88±5)%,Ang-Ⅱ-MSCs组创面的愈合率最高,且该组创面组织的结构较完整,新生微血管数量较多、胶原排列更规整以及上皮化的程度更佳。(3)Ang-Ⅱ预处理后的h UCMSCs上清液(Ang-Ⅱ-CM)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、凋亡、新生血管影响的机制研究:Ang-Ⅱ-CM对HUVEC增殖、凋亡、新生血管影响的研究结果表明,与CM组相比,Ang-Ⅱ-CM组与MSCs-CM组中HUVEC的形态和结构均较好,其中Ang-Ⅱ-CM组凋亡细胞或死亡细胞最少,血管形成数量和细胞的增殖活性最好,MSCs-CM组次之。两组抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平均较CM组高,促凋亡蛋白Caspase-3的表达水平也较CM组低,而Ang-Ⅱ-CM组则更为显著。进一步使用si RNA干扰HUVEC中VEGFR2后,结果显示:与si RNA-Control组相比,si VEGFR2组中Bcl-2表达量降低,Caspase-3表达量增高。此外,si VEGFR2组中凋亡细胞数量也较si RNA-Control组显著增加,而新生微血管的数量则显著减少。因此,VEGF和VEGFR2以及下游调控的Caspase-3和Bcl-2信号是h UCMSCs发挥促内皮细胞增殖、抗内皮细胞凋亡以及促内皮新生微血管的潜在机制。结论:综上所述,适宜浓度(100ng/m L)Ang-Ⅱ预处理的h UCMSCs可促进其的增殖、减少凋亡,通过旁分泌高水平的VEGF,与内皮细胞上的VEGFR2结合,抑制下游的促凋亡蛋白Caspase-3和增加抗凋亡蛋白Bc-2的表达,发挥进促内皮细胞存活、增殖和抗内皮细胞凋亡能的作用,进而显著促进了猪全层皮肤缺损性创面的愈合。
[Abstract]:Objective : Human umbilical cord mesenchymal stem cells ( hUCMSCs ) were used as a new type of MSCs . The transplantation of human umbilical vein endothelial cells ( hUCMSCs ) was one of the hot spots in the research of stem cells . Methods : ( 1 ) The effect of Ang - 鈪，

本文编号：1672457