人表皮干细胞lncRNA与mRNA差异表达相关性及其作为ceRNA的作用分析

发布时间：2018-12-29 08:40

【摘要】：目的:观察人表皮干细胞和已分化的角质形成细胞中lncRNA和mRNA的差异表达及其相关性,初步探索lncRNA作为竞争性内源性RNA(ceRNA)参与调控表皮干细胞的自我更新及分化,获得更多有关表皮干细胞体外复制、扩增和分化调控的新信息,为组织工程构建皮肤提供更理想的种子细胞来源,为未来创面愈合的基因治疗提供线索。方法:(1)取泌尿外科行包皮环切术患者的正常包皮组织,采用酶消化法和Ⅳ型胶原快速贴壁法获得A组人表皮干细胞、B组角质形成细胞。倒置显微镜下观察两组细胞的生长状况,免疫细胞化学染色法行β1整合素、CK1、CK10、CK19单抗检测鉴定。用Trizol一步法分别提取2组细胞总RNA并质检,纯化后进行荧光标记、芯片杂交,然后扫描得到杂交图片,利用软件提取数据并行差异性分析,同时应用RT-PCR法验证芯片结果的可靠性。对差异表达的蛋白编码基因行GO分析和Pathway分析。(2)结合以往文献报道,通过UCSC在线软件对本试验中表皮干细胞中差异表达Lnc RNA进行整合,归纳总结出差异表达的反义链型lncRNA、正义链型lncRNA、增强型lncRNA及基因间lncRNA。接着利用BLAST在线软件检测差异表达的外显子正义链型lncRNA和其邻近差异表达蛋白编码基因的碱基相似性,以寻找可能的竞争性内源性lncRNA,结果发现差异表达NR_073046和NR_045013分别与邻近蛋白编码基因序列高度相似,故借助靶基因预测软件Targetscan及miRanda分别对其可能结合的靶mi RNA进行预测,以进一步预测这两个lncRNA的竞争性结合机制。除此以外,计算4个异常表达的lncRNA和mRNA的皮尔森系数,以相关系数的绝对值大于0.99且P值小于0.001为阈值,寻找共表达lncRNA-mRNA对,并构建了lncRNA-mRNA共表达调控网络图,并对差异lncRNA靶基因进行了GO分析及Pathway分析,以更好地验证lncRNA与m RNA的相关性。结果:(1)快速黏附于Ⅳ型胶原的A组细胞培养3 d能形成明显克隆,免疫细胞化学染色显示β1整合素及CK19呈阳性表达,符合表皮干细胞特征;不能快速黏附于Ⅳ型胶原的B组细胞培养3 d无明显克隆形成,CK1及CK10呈阳性表达,符合角质形成细胞的特征。提取两组细胞总RNA质检合格后筛选出3720条lncRNA和4069条mRNA有差异性表达,其中2292条lncRNA明显上调,1428条lncRNA明显下调,1248条mRNA明显上调,2821条mRNA明显下调,RT-PCR验证结果与芯片检测结果具有较好的一致性,且GO分析条目涵盖增殖、生长、凋亡等条目。(2)对差异表达的lncRNA行亚类分析,发现其中有165条反义链型lncRNA,759条外显子正义链型lncRNA,293条增强型lncRNA以及768条基因间型lncRNA。紧接着对外显子正义链型lncRNA行碱基相似性分析发现15条lncRNA与邻近蛋白编码基因相似基序列达到90%以上,其中差异表达NR_073046和NR_045013分别与邻近蛋白编码基因DEDD2和LMO3的相似序列达到100%。进一步的靶miRNA预测,发现NR_073046可与DEDD2竞争性互补配对结合432条miRNA,其中有10条miRNA为高度互补配对且相对保守,比如miR-204-5P/211-5p,NR_045013可与LMO3竞争性互补配对结合960条miRNA,其中有62条miRNA是高度互补配对且相对保守,比如miR-200a-3p/141-3p,miR-489-3p,miR-199-5p,而且lncRNA-mRNA共表达分析表明NR_073046和NR_045013分别与DEDD2和LMO3的表达存在相关性。结论:(1)体外培养的人表皮干细胞与角质形成细胞lncRNA与mRNA表达谱存在明显差异,这可能与两者不同的增殖分化能力等生物学特性有关。(2)差异表达的NR_073046和NR_045013可能通过竞争性内源性机制结合miRNA,分别调控相应蛋白编码基因DEDD2和LMO3的表达,从而参与表皮干细胞的自我更新及分化,为创面愈合的治疗提供了新的理论基础。
[Abstract]:Objective: To observe the differential expression and correlation of lncRNA and mRNA in human epidermal stem cells and differentiated keratinocytes, and to explore the self-renewal and differentiation of lncRNA as a competitive endogenous RNA (cRNA) in the control of epidermal stem cells, and to obtain more in vitro replication of epidermal stem cells. The new information of the regulation of amplification and differentiation provides a more ideal source of seed cell for the construction of the skin of the tissue engineering, and provides a clue for gene therapy of the wound healing in the future. Methods: (1) The normal prepuce tissue of the patients with prepuce circumcision was taken, and the human epidermal stem cells and B-group keratinocytes were obtained by the method of enzyme digestion and the rapid adherence of type 鈪，

本文编号：2394597