体外研究人脐带血间充质干细胞诱导大鼠枯否细胞M2极化

发布时间：2019-04-23 09:45

【摘要】：目的众所周知,目前晚期肝硬化患者除肝移植外无较好的治疗方法,但肝移植供体紧缺,配型复杂,等待周期长,移植费用高,极大的限制了肝移植的临床应用。随着干细胞替代治疗研究的兴起,目前干细胞移植有望成为终末期肝病的有效治疗方法。间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)具有强大的分化能力能为许多终末期疾病带来希望,是一种多能干细胞。具有提取方法简单,低成本,低免疫性等特点。随着研究的深入,越来越多的证据表明MSCs通过免疫调节或者分泌细胞因子的机制来调节炎症反应和组织修复,从而发挥其主要的治疗作用。本实验采用内毒素(lipopolysaccharide,LPS)诱导大鼠枯否细胞(kupffer cells,KCs)发生极化改变,之后用人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,hu MSCs)与LPS诱导的KCs在transwell内共培养,观察hu MSCs对KCs极化偏移的调节作用,进一步来研究MSCs对炎症免疫调节及其作用机制。方法采用胶原酶在体灌注和离体消化、密度梯度离心和选择性贴壁法,并结合机械分离和振荡孵育,最大程度的消化SD大鼠肝组织从而高效得到更多的原代KCs。经过形态观察,吞噬功能检测,细胞表面标志检测等方法验证细胞。成功取得KCs后,进行培养。同时进行hu MSCs细胞培养,观察,验证。之后将KCs与MSCs在Transwell内共培养。实验分为KCs组(正常组),KCs细胞+LPS组(对照组),MSCs+KC+LPS组(实验组)。实验组用经典的LPS刺激原代大鼠KCs发生极化后再与hu MSCs共培养18h,正常组加入等量DMEM培养基,对照组在LPS刺激后,加入DMEM培养基作为对照。观察同一时间点各组的IL-4,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α),IL-10,IL-6等上清因子变化,以上上清因子用ELISA法进行检测;用Westing-blot方法检测诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase,i NOS),精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1),信号传导与转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)STAT-3,STAT-6,核因子kappa B(nuclear factor-k B,NF-κB)。同时用q RT-PCR对以上结果进行验证。检测结果采用统计学软件分析,均数±标准差(X±S)表示,F检验判断两样本间的方差齐性,多组间差异检验采用单因素方差分析,t检验分析两组间统计学差异。结果对照组促炎因子TNF-α分泌增加,实验组抑炎因子IL-10,IL-4分泌增加,而IL-6的分泌实验组升高更明显;而Western-blot检测表明对照组中i NOS升高,NF-κBp65入核增高,而实验组高表达Arg-1,同时p STAT-3,p STAT-6表达增加,NF-κBp65入核减少,但是NF-κBpp65核内增多。经统计学检测结果提示hu MSCs与枯否细胞极化后共培养后与对照组及空白组存在明显差异。结论分析以上数据结果表明hu MSCs能诱导KCs向M2表型偏移,主要表现为抗炎因子分泌增加,Arg-1合成增加,考虑可能与hu MSCs分泌细胞因子有关,起到一种免疫调节作用,hu MSCs调节巨噬细胞极化的分子机制可能与通过JAK-STAT信号转导通路有关。该结论首次用不同种属细胞共培养研究巨噬细胞极化问题,且采用原代大鼠枯否细胞,更具有研究意义。同时该实验说明已经极化的枯否细胞是可以发生M2极化改变,但M2极化的巨噬细胞来源有待进一步验证。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R657.3
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本文编号：2463353