干细胞对人皮肤组织修复再生作用及关键调控因子的研究
发布时间：2020-01-27 09:19
【摘要】：目的:探究干细胞对皮肤修复与再生作用及关键调控因子。一方面,观察间充质干细胞(MSCs)的培养基对光老化表皮细胞的修复再生作用,研究有效分泌因子及其作用机制,为皮肤抗老化及去分化提供新的方法。另一方面,在前期研究的基础上,利用去分化源性表皮干细胞对人配对盒(Pairedbox6,Pax6)基因DNA甲基化调节在汗腺再生过程中的关键作用进行验证,并对汗腺样细胞进行安全性评价,进一步分析关键调控因子诱导汗腺再生的作用机制。方法:利用定量紫外线照射人永生化表皮细胞(HaCaT)构建表皮细胞光老化模型,培养人绒毛膜间充质干细胞(CDSCs),将不同浓度的人绒毛膜间充质干细胞上清液(CDSC-CNM)作用光老化表皮细胞,通过细胞迁移、荧光探针、彗星分析实验等测定细胞增殖、活性氧自由基(radical oxygen species, ROS)生成量、DNA损伤的变化,观察其抗老化修复再生作用;检测有效分泌因子,并通过Western blot测定相关通路蛋白,分析其作用机制。构建Pax6真核表达载体,培养去分化源性表皮干细胞,设置实验分组。将Pax6质粒转染至去分化源性表皮干细胞并通过G418筛选稳定表达细胞系,加入甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC)继续培养,利用Realtime-PCR检测Pax6的mRNA表达情况,应用免疫荧光法检测C E A、C K7等汗腺标志物,并进行裸鼠脚掌汗腺移植再生的验证及安全性评价。结果:成功构建了人表皮细胞光老化模型,一定浓度的CDSC-CNM对光老化表皮细胞有修复再生作用,可以有效增强细胞活力、减少ROS生成量并减轻DNA损伤程度。CDSC培养基检测发现,表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、白介素-6 (IL-6)及IL-8可能为有效的分泌因子,并通过JAK/STAT、MAPK等信号通路机制发挥作用。构建了 Pax6真核质粒,转染Pax6质粒的去分化源性表皮干细胞经过G418筛选后形成阳性克隆,Realtime-PCR及Western blot结果显示,Pax6+5-Aza-dC组细胞中CEA、CK7的mRNA及蛋白均有表达,免疫荧光染色结果显示,Pax6+5-Aza-dC组细胞的CEA、CK7蛋白呈阳性表达。碘淀粉发汗实验结果显示,大约7/10使用Pax6+5-Aza-dC组细胞进行脚掌移植的裸鼠可见阳性结果,组织学检查发现,HE染色切片中Pax6+5-Aza-dC组可见再生的汗腺结构,皮肤基底层部位的汗腺导管相互连接,而对照组则没有发现类似汗腺的结构。接种汗腺样(SGL)细胞的实验组接种处没有出现肿物,接种胃癌(MGC-803)细胞的对照组三周(w)后显示背部肿物,组织切片观察,实验组的组织中未见异常或肿瘤细胞而对照可见大量异型肿瘤细胞组织。结论:人绒毛膜间充质干细胞上清液对人光老化表皮细胞具有修复再生作用,其中b-FGF、EGF、TGF-β、IL-6及IL-8等细胞分泌因子发挥着关键作用,这为皮肤抗老化的预防治疗提供了新的方法,也为表皮细胞去分化提供了诱导条件。Pax6和5-Aza-dC共同作用可以促使去分化源性表皮干细胞转化为SGL细胞,并表达出CEA、CK7等汗腺特异性标志物,验证了 SGL细胞在裸鼠模型中的生物学功能,移植瘤实验证明了 SGL细胞的安全性,为临床大面积汗腺损伤的患者实现汗腺再生带来希望。通过深入探讨Pax6甲基化调控机制,汗腺再生的理论体系将进一步得到完善。
【图文】：
３．结果逡逑３．１邋ＣＤＳＣ细胞的表面抗原特征逡逑显微镜下观察，ＣＤＳＣ为成纤维细胞样形态（图１Ａ）。流式细胞仪显示，ＣＤＳＣｓ逡逑表达间充质干细胞（ＭＳＣｓ）的特异性表型，ＣＤ７３、ＣＤ９０和ＣＤ１０５表面抗原呈阳性，逡逑ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５和ＨＬＡ－ＤＲ表面抗原呈阴性（图１Ｃ）。逡逑ＭＢ逡逑Ｃ逦ＣＤ７３逦ＣＤ９０逦ＣＤ１０５逡逑｜：ｊ逦Ｉ］逦！逡逑Ｉ：卜１￣￣『ｉ；：丨邋ｆ邋Ｉ逡逑：NB美：１丨，廔Ｊ逦■赢Ｉ逡逑Ｋｒ邋ｔｏ＇邋Ｕｒ邋ｔｏ３邋１０邋ｉ0°邋ｉ0＇邋Ｗｒ邋ｉ（ｒ邋ｉ＃rP々g纆篯3?９７．９９％逦９７．３５％逦９７．４６％逡逑ＣＤ１９逦ＣＤ３４逦ＣＤ４５逦ＨＬＡ－ＤＲ逡逑ｉｒ逦ｉｒ逡逑ｌｌ邋４邋１逦＾邋ｌｌ邋Ｌ邋１逦＾邋ＩＩＩ邋Ａ邋１逦＾邋Ｉｄ邋Ｉｋ邋１逦＾邋｜逡逑Ｔ逦Ｔｏ３邋１０４逦＜０？逦＇？＊逦１０°逦Ｉ０１邋ｌ0２邋｜0３逦１０＊逡逑１．０６％逦０．１８％逦０．５９％逦０．７５％逡逑图１胎盘来源间充质干细胞的特征。（Ａ）胎盘来源间充质干细胞的形态，表现出成纤维细胞逡逑样形态（ｘｌＯＯ）。（Ｂ）正常ＨａＣａＴ细胞形态。（Ｃ）流式细胞仪分析显示ＣＤＳＣｓ具有间充质干逡逑细胞的特异性表型，表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５呈阳性，ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ逡逑呈阴性。逡逑１８逡逑
正常的ＨａＣａＴ细胞培养在ＧＭ中，细胞贴壁生长，形态呈上皮样，多角形（图逡逑１Ｂ）。经过定量ＵＶＢ辐射后形成光老化的ＨａＣａＴ细胞，通过ＧＭ、ＣＭ继续培养检逡逑测，其细胞增殖率与正常ＨａＣａＴ细胞相比明显下降（图２）。逡逑国逦｜逡逑＾邋２．５０邋－｜逦ＤＮｏｒｍ＾ｌｌＵＣ＾Ｔｃｅｍ逡逑§逡逑Ｓ逦＾逦ＰＰｔｉｏｔｏ＾ａｇｅｄ邋ＨａＣａＴ邋ｃｅｌｌｉ逡逑ｇ邋２．栜－邋工0一逦＊逡逑翁逦＿ＬＺ？逡逑Ｓ邋％Ｍ邋－逡逑！？}0—１－６８Ｓ逡逑ｇ逡逑＾邋ａｓｏ逦－逦？逦＾逡逑Ｗ逦邋邋ＷＫＥｍ逡逑－邋—逡逑９．ｍ逦Ｕ逦ｊ逦逦Ｐ＊＊＂—，逡逑ＧＭ逦ＣＭ逡逑图２成功建立了光老化表皮细胞模型。培养在生长培养基（ＧＭ）和对照培养基（ＣＭ）中的光老化逡逑ＨａＣａＴ细胞增殖率与正常表皮细胞增殖率相比均明显降低。逡逑３．３邋ＣＤＳＣ－ＣＮＭ提高光老化ＨａＣａＴ细胞增殖率逡逑尽管光老化ＨａＣａＴ细胞比正常ＨａＣａＴ细胞的细胞增殖率明显下降，但光老化逡逑ＨａＣａＴ细胞经ＣＤＳＣ－ＣＮＭ作用后，其细胞增殖率比ＣＭ作用后有明显X椉印Ｆ渲校义显鲋陈试龇畲蟮氖蔷罚担ィ茫模樱茫茫危妥饔煤蟮墓饫匣龋幔茫幔韵赴ㄍ迹常ｅ义希保瑰义
本文编号：2573586
【图文】：
３．结果逡逑３．１邋ＣＤＳＣ细胞的表面抗原特征逡逑显微镜下观察，ＣＤＳＣ为成纤维细胞样形态（图１Ａ）。流式细胞仪显示，ＣＤＳＣｓ逡逑表达间充质干细胞（ＭＳＣｓ）的特异性表型，ＣＤ７３、ＣＤ９０和ＣＤ１０５表面抗原呈阳性，逡逑ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５和ＨＬＡ－ＤＲ表面抗原呈阴性（图１Ｃ）。逡逑ＭＢ逡逑Ｃ逦ＣＤ７３逦ＣＤ９０逦ＣＤ１０５逡逑｜：ｊ逦Ｉ］逦！逡逑Ｉ：卜１￣￣『ｉ；：丨邋ｆ邋Ｉ逡逑：NB美：１丨，廔Ｊ逦■赢Ｉ逡逑Ｋｒ邋ｔｏ＇邋Ｕｒ邋ｔｏ３邋１０邋ｉ0°邋ｉ0＇邋Ｗｒ邋ｉ（ｒ邋ｉ＃rP々g纆篯3?９７．９９％逦９７．３５％逦９７．４６％逡逑ＣＤ１９逦ＣＤ３４逦ＣＤ４５逦ＨＬＡ－ＤＲ逡逑ｉｒ逦ｉｒ逡逑ｌｌ邋４邋１逦＾邋ｌｌ邋Ｌ邋１逦＾邋ＩＩＩ邋Ａ邋１逦＾邋Ｉｄ邋Ｉｋ邋１逦＾邋｜逡逑Ｔ逦Ｔｏ３邋１０４逦＜０？逦＇？＊逦１０°逦Ｉ０１邋ｌ0２邋｜0３逦１０＊逡逑１．０６％逦０．１８％逦０．５９％逦０．７５％逡逑图１胎盘来源间充质干细胞的特征。（Ａ）胎盘来源间充质干细胞的形态，表现出成纤维细胞逡逑样形态（ｘｌＯＯ）。（Ｂ）正常ＨａＣａＴ细胞形态。（Ｃ）流式细胞仪分析显示ＣＤＳＣｓ具有间充质干逡逑细胞的特异性表型，表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５呈阳性，ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ逡逑呈阴性。逡逑１８逡逑
正常的ＨａＣａＴ细胞培养在ＧＭ中，细胞贴壁生长，形态呈上皮样，多角形（图逡逑１Ｂ）。经过定量ＵＶＢ辐射后形成光老化的ＨａＣａＴ细胞，通过ＧＭ、ＣＭ继续培养检逡逑测，其细胞增殖率与正常ＨａＣａＴ细胞相比明显下降（图２）。逡逑国逦｜逡逑＾邋２．５０邋－｜逦ＤＮｏｒｍ＾ｌｌＵＣ＾Ｔｃｅｍ逡逑§逡逑Ｓ逦＾逦ＰＰｔｉｏｔｏ＾ａｇｅｄ邋ＨａＣａＴ邋ｃｅｌｌｉ逡逑ｇ邋２．栜－邋工0一逦＊逡逑翁逦＿ＬＺ？逡逑Ｓ邋％Ｍ邋－逡逑！？}0—１－６８Ｓ逡逑ｇ逡逑＾邋ａｓｏ逦－逦？逦＾逡逑Ｗ逦邋邋ＷＫＥｍ逡逑－邋—逡逑９．ｍ逦Ｕ逦ｊ逦逦Ｐ＊＊＂—，逡逑ＧＭ逦ＣＭ逡逑图２成功建立了光老化表皮细胞模型。培养在生长培养基（ＧＭ）和对照培养基（ＣＭ）中的光老化逡逑ＨａＣａＴ细胞增殖率与正常表皮细胞增殖率相比均明显降低。逡逑３．３邋ＣＤＳＣ－ＣＮＭ提高光老化ＨａＣａＴ细胞增殖率逡逑尽管光老化ＨａＣａＴ细胞比正常ＨａＣａＴ细胞的细胞增殖率明显下降，但光老化逡逑ＨａＣａＴ细胞经ＣＤＳＣ－ＣＮＭ作用后，其细胞增殖率比ＣＭ作用后有明显X椉印Ｆ渲校义显鲋陈试龇畲蟮氖蔷罚担ィ茫模樱茫茫危妥饔煤蟮墓饫匣龋幔茫幔韵赴ㄍ迹常ｅ义希保瑰义
本文编号：2573586
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/waikelunwen/2573586.html
最近更新
教材专著
