Microarray分析BMSCs-ASCs联合移植修复脊髓损伤的分子机制

发布时间：2020-03-28 22:07

【摘要】：【目的】本研究团队前期实验发现,骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)联合激活态雪旺细胞(Activated Schwann cells,ASCs)移植修复脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI),效果显著,其原因在于改善局部损伤微环境,但具体作用机制不明。本实验采用基因芯片(Microarray)技术筛选BMSCs联合ASCs移植后,局部损伤组织中的差异表达基因。通过对差异基因的生物信息学分析,找到细胞联合移植治疗脊髓损伤的内在作用机制,找到关键基因以及重要通路,为进一步优化细胞移植修复脊髓损伤策略和临床转化应用提供理论依据。【方法】1.移植种子细胞培养及鉴定:采用骨髓腔冲洗分离培养大鼠BMSCs,并应用流式细胞术检测胞膜表面分子鉴定BMSCs。应用坐骨神经预损伤激活和胶原酶消化分离培养SCs,采用S100免疫荧光染色鉴定SCs。2.实验动物及分类:4周龄雄性Wistar大鼠10只,体重在(80±10)g之间,用于提取骨髓间充质干细胞和雪旺细胞,且用于移植的两种细胞来源于同一老鼠。8周龄健康成年Wistar雌性大鼠54只,体重在(200±30)g之间,用于细胞移植后基因芯片检测,将大鼠随机分为6组(每组9只):A组DMEM对照7天组;B组DMEM对照14天组;C组DMEM对照28天组;D组BMSC联合ASC移植7天组;E组BMSC联合ASC移植14天组;F组BM-SC联合ASC移植28天组。3.SCI动物模型建立及细胞移植:采用成年雌性Wistar大鼠,利用NYU ImpactorII型打击装置建立胸10节段脊髓挫伤模型,打击重量为l0g,高度为2.5 cm。在损伤后7天,使用Hamilton微量注射器分别将DMEM,ASCs与BMSCs混合悬液缓慢注射入脊髓损伤区域,注射剂量为每只15μL,每只动物移植的细胞总数共3.0×10~5个,注射时间5-10min。为防止细胞倒流,留针5min。分别在移植后7天,14天,28天行心脏灌注,取出损伤区域0.5 cm组织。4.生物信息学学分析:在相应时间点将大鼠断头处死,切取伤段脊髓标本,使用Trizol抽提RNA。使用所提取的RNA合成cDNA,合成并扩增cRNA,然后进行cRNA的纯化,继而进行芯片杂交、芯片扫描,最后进行数据分析,按照差异倍数大于2,p小于0.05标准,得出相应差异基因。对差异基因分别进行GO功能富集分析与KEGG通路分析。【结果】成功绘制出BMSCs联合ASCs细胞联合移植修复脊髓损伤微环境的差异基因表达谱,细胞联合移植后7天组差异基因一共44个,其中上调基因的为20个,下调基因的为24个;细胞联合移植后14天组差异基因606个,上调的为386个,下调的为218个;细胞联合移植后28天组得到的差异基因数分别为50个,其中上调及下调的基因数分别为23个、27个。【结论】1.通过生物信息学分析筛选与脊髓损伤修复相关的部分关键基因。其中,Ppp1r12a、Npc1和Ngb基因达差异显著,且与抑制细胞凋亡,改善局部微环境相关,Nrsn1、Cyp26a1 Mmp12基因与促进轴突再生、促进突触重塑相关,S100A8/A9基因调节体内细胞增殖和凋亡、炎症反应相关。2.植后7天,动物体内发生这抑制炎症免疫反应、抗凋亡等生物学过程,移植后14天,细胞联合治疗中期阶段,动物体内主要发生的着轴突再生,突触重塑等生物学过程质,移植后28天,动物体内出现新的蛋白的再生,细胞的复制等。
【图文】：

ASCs荧光显微镜下(400倍)S100和DAPI染色

BMSCs流式细胞鉴定
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R651.2

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 冯世庆;周先虎;孔晓红;陈家童;李晖;侯巍;王沛;郭世绂;;自体激活雪旺细胞移植治疗急性脊髓损伤的实验研究[J];中华骨科杂志;2006年08期

相关硕士学位论文 前1条

1 王慧玲;线粒体钙单向转运体在1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞凋亡中的作用[D];南方医科大学;2015年

，

本文编号：2604978