【摘要】：恶性肿瘤早期转移并对化疗药物耐受是导致肿瘤患者治疗失败的重要原因,然而目前常用的广谱性抗肿瘤药物缺乏对相关耐药基因的抑制功能,单纯加大药物剂量不但没有提高疗效反而引起了严重的副反应,目前临床急需探明与耐药相关的基因,并寻找有效的靶向调控药物。近年来通过临床对不同分期的肿瘤组织进行基因及蛋白差异性表达的筛查证实高恶性度的多种肿瘤中,包括前列腺癌、膀胱癌、小细胞肺癌以及恶性胶质瘤等均有分化抑制因子(inhibitior of differentation,Id)的异常高表达,进一步研究也表明Id家族中的Id1对肿瘤的发生发展、耐药以及转移过程均具有重要的研究价值。现认为,一方面高表达Id1会促使肿瘤细胞形成转移,Hao等人的研究就提出患有高表达Id1的骨肉瘤患者组较低表达Id1组更容易出现对周围组织的侵犯与转移,最终引起死亡率上升;Chen等人对小细胞肺癌的研究中也有类似观点,他们证实高恶性度的N417细胞系较良性细胞系Beas-2B表达更多的Id1,且与肿瘤的转移联系紧密,而有效敲除Id1不但降低了肿瘤的增殖,还下调了血管生成有关的VEGF分子表达。另一方面,越来越多证据显示肿瘤细胞中持续表达Id1对肿瘤在化疗药物治疗下存活的重要性:1、抑制Id1表达不但减少了肿瘤发生耐药性的可能,而且研究表明抑制Id1异常高表达能够有效抑制肿瘤组织的大小,并且提高化疗药物如多柔比星、顺铂等效果。Cheng等人对小细胞肺癌的研究中发现:虽然Id1高表达的肿瘤体积往往较Id1阴性组更大,但Id1高表达组化疗后如果能抑制Id1的表达,杀伤肿瘤效果往往比Id1阴性组更明显,进而明显延长无病生存时间和总生存率,因此近年学者提出Id1可作为针对肿瘤靶向治疗重要的靶点,借由消除异常表达Id1消除相关肿瘤的活性与耐药性。骨肉瘤是目前骨科最常见的恶性肿瘤,一方面其好发于肱骨近端、胫骨干骺端以及股骨,影响患肢功能和预后。目前单纯手术切除病灶疗效不理想,资料显示不进行辅助化疗的患者局部复发以及远处转移发生几率明显增高,且5年生存率不到20%[1]。临床研究以及指南推荐顺铂、阿霉素、环磷酰胺作为骨肉瘤的一线化疗药物[2],且20世纪70年代辅助化疗应用于治疗骨肉瘤后,有效的化疗辅助下患者5年生存率可提高至60%～70%[2],故有效的辅助化疗是预防保肢患者复发的主要手段。另一方面,骨肉瘤高发于青少年和老年人,需要减少用药剂量以避免大剂量的化疗药物引起的毒副反应,但骨肉瘤耐药性导致部分患者肿瘤复发并影响生存率的现象近年来并没有得到进一步改善[3]。因此减少骨肉瘤耐药的发生、提高患者预后是目前临床工作的重点。骨肉瘤作为分化异常的成骨细胞,分化抑制因子1(Id1)异常高表达在肿瘤中发挥重要功能。已有研究证实骨肉瘤高表达Id1[4],且Enneking分级越高的骨肉瘤中这种异常越明显,说明Id1与肿瘤恶性程度间的关联。此外,Id1 是骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信号通路下游重要的信号靶点,通过对目的靶基因转录以及相关蛋白的调控作用在骨肉瘤细胞中发挥重要功能[5]。研究证实Id1在多种疾病中存在核转移现象,并通过介导与细胞存活、增殖、迁移以及耐药相关基因转录发挥功能[6]。因此,有效抑制Id1这种负性调控基因参与转录能有效抑制Id1相关耐药性的产生,从而提高患者的化疗效果[7]。目前研究显示,包括顺铂在内的多种化疗药物均不能抑制多种肿瘤中高表达的Id1,且研究显示Id1表达能够介导肿瘤细胞对顺铂等化疗药物耐药性的产生,导致化疗失败[8]。课题组成员早在2004年一项报道中就阐述了 Id基因家族对骨分化的重要性,在成骨干细胞早期表达Id1有利于细胞增殖,敲除Id1的表达会影响BMPs尤其是BMP9的成骨作用,而近年我们进一步探索发现骨细胞成熟异常引起的成瘤现象是导致骨肉瘤发生的重要原因。本校的另一项研究项目也证实了 Id基因在间充质干细胞成骨分化异常中的作用,均揭示了抑制Id1异常对骨肉瘤成骨分化的积极意义。虽然目前普遍认可Id1的表达异常贯穿多种肿瘤的发生发展及转移的整个病理过程,但仍对Id1蛋白在肿瘤细胞中异常表达的原因及具体作用机制仍不完全明确。一、骨肉瘤高表达Id1并介导对顺铂耐药性的产生目的分析分化抑制因子1(inhibitor of differentiation 1,Id1)在骨肉瘤患者与正常人(骨关节炎患者)的表达水平差异,明确临床切除组织中Id1在骨肉瘤中高表达;探讨顺铂对3种骨肉瘤细胞MG63,143b以及HOS中Id1表达的作用,探讨沉默Id1基因对骨肉瘤顺铂耐药性的影响。方法1.收集12例骨肉瘤患者的石蜡切片以及12例骨关节炎全膝关节置换术后骨组织切片,通过免疫组化分析两组间Id1表达差异。2.利用顺铂处理MG63、143b以及HOS细胞株,通过Western blot技术检测Id1表达水平的变化;3.免疫荧光技术分析Id1在顺铂作用的核位移现象;4.构建Id1稳定沉默的MG63-Id1、143b-Id1以及HOS-Id1,采用CCK-8以及流式细胞学技术分析Id1对骨肉瘤细胞株抗凋亡作用的影响。结果1.免疫组化结果提示Id1在骨肉瘤组织中表达明显高于对照组;Id1在转移灶中肿瘤组织与周围间质成明显差异。2.高浓度顺铂介导3种骨肉瘤细胞株表达Id1;3.免疫荧光提示顺铂介导骨肉瘤细胞中Id1的核转移;4.免疫荧光提示顺铂介导了骨肉瘤中Id1与p65在核内的交联。5.Id1稳定敲低组对顺铂敏感性明显升高。结论骨肉瘤患者病变组织表达高水平的Id1,这种改变具有较高的组织特异性,因此针对Id1表达的药物可能具有较高的肿瘤组织特异性而避免影响其他正常的组织,具有一定的临床意义。同时,敲除Id1组对顺铂的敏感性提高(细胞活性以及凋亡程度上具有明显差异,P0.05),证实了抑制Id1对治疗骨肉瘤的积极作用。但Id1不仅不能够被顺铂有效的抑制,且骨肉瘤组织表达的Id1通过核转移,并通过与p65交联参与调控基因转录参与了肿瘤细胞株对顺铂的耐药作用,因此寻找能有效抑制Id1的化疗药物提高顺铂作用是迫切的。二、辣椒碱通过NF-kB以及TGF信号通路抑制骨肉瘤细胞株表达Id1目的研究辣椒碱能否有效的抑制骨肉瘤中Id1的表达,并探讨其作用方式以及信号通路,为后续联合顺铂治疗骨肉瘤提供基础。方法1.通过不同浓度(0-250umol/L)辣椒碱单独作用于MG63、143b以及HOS细胞株,以及不同时间下,收集细胞。2.通过Western Blot以及qPCR阐明其抑制Id1的作用方式。3.利用Western Blot探讨辣椒碱抑制Id1的可能途径。4.加用NF-kB以及TGF家族信号抑制剂证实上诉通路与辣椒碱作用于Id1的关系,分析Id1与这些通路间的关联。结果1.辣椒碱能够有效抑制肿瘤细胞中Id1的蛋白表达,同时介导肿瘤细胞中mRNA的扩增。2.信号通路抑制剂提示NF-kB家族中p65的活化会介导Id1蛋白的稳定性,而辣椒碱介导TGF下游Smad2蛋白的磷酸化是辣椒碱提高Id1的重要因素;结论辣椒碱能够通过浓度以及时间依赖的方式抑制骨肉瘤细胞株中Id1蛋白稳定性并提高Id1的转录水平。辣椒碱抑制Id1与抑制AKT-IKB-p65信号通路的磷酸化密切相关。辣椒碱提高Id1转录与TGF信号通路活化而非BMP信号通路活化密切相关,说明骨肉瘤中Id1的表达不仅仅与Smad1/5有关,证实了调控Id1的复杂性。加用上诉通路抑制剂后证实AKT-IKB-p65信号通路可以影响Id1的表达以及TGF家族信号传导,证实两者在影响Id1上的密切关系,而辣椒碱通过改变上诉通路最终抑制了 Id1的蛋白。三、辣椒碱抑制顺铂介导的Id1表达及核转移提高骨肉瘤对顺铂的敏感性目的研究体外实验中通过联合辣椒碱验证其加强骨肉瘤的化疗作用,并探讨上诉辣椒碱抑制Id1相关信号通路在两者联合应用中提高骨肉瘤对顺铂敏感性的作用。方法1.辣椒碱联合顺铂应用于骨肉瘤细胞株,应用于MG63、143b以及HOS细胞株;利用CCK8实验检测细胞活性2.流式细胞学分析辣椒碱对顺铂引起凋亡作用影响3.Western blot分析两者在Id1相关信号分子机制的差异。4.免疫荧光证实辣椒碱能有效抑制顺铂介导的Id1入核作用。结果1.联合应用下辣椒碱能明显加强顺铂介导的细胞活性下降2.流式细胞学实验证实辣椒碱能够有效加强顺铂对辣椒碱的作用3.辣椒碱通过抑制顺铂引起的p65以及Smad1/5的磷酸化抑制肿瘤细胞表达Id14.免疫荧光提示联合辣椒碱介导Id1环膜现象,结合核内蛋白Western blot分析证实辣椒碱有效抑制顺铂引起的Id1入核现象。结论辣椒碱联合顺铂能够明显加强对骨肉瘤的化疗效果,进一步实验证实辣椒碱能够有效消除顺铂介导的NF-kB信号通路以及TGF家族信号通路的改变。上诉通路最终导致Id1的明显下降。应用辣椒碱后抑制了 Id1的入核现象,也暗示了对Id1作用的抑制。通过抑制蛋白量以及功能后削弱了 Id1对顺铂的耐药作用,促进骨肉瘤细胞凋亡。
【图文】：
２．３免疫荧光检测应用顺yP后Ｉｄｌ表达部位逡逑根据免疫荧光提示静止状态下３种细胞株表达的Ｉｄｌ蛋白主要存在于细胞质中，逡逑而当应用一定剂量的顺铂后，骨肉瘤中Ｉｄｌ的核质荧光比出现倒转，结合图２中Ｉｄｌ逡逑总量上升
根据免疫荧光提示静止状态下３种细胞株表达的Ｉｄｌ蛋白主要存在于细胞质中，逡逑而当应用一定剂量的顺铂后，骨肉瘤中Ｉｄｌ的核质荧光比出现倒转，结合图２中Ｉｄｌ逡逑总量上升，提示顺铂能介导Ｉｄｌ的入核。详见
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R738
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本文编号：
2620075
