【摘要】：第一部分不同抗凝剂保存的富血小板血浆在围体外循环期的质量比较研究目的本研究将拟在离体状态下,评价全身肝素化后、体外循环前通过静脉引流管放血行自体血细胞分离获得的血小板质量。通过多个对照组的对比,比较不同的抗凝剂对自体富血小板血浆的分离及保存效果,探索肝素抗凝的富血小板血浆在体外循环患者中应用是否安全可行。研究方法2017年1月至2017年08月,选择本院20例拟行体外循环手术的成人患者作为研究对象,把同一患者同一时间抽取的静脉血分为枸橼酸抗凝组(Sodium citrate,SC)和肝素抗凝组(Heparin),并以EDTA抗凝管采的血样为对照组1,以血站制备的机采浓缩血小板为对照组2,并与体外循环停机后的全血(对照组3)作比较,每组各20例。患者入室麻醉后,经颈内静脉置管抽取静脉血20ml分别注入多只枸橼酸抗凝管及肝素抗凝管内,每管各含2.7 ml全血以及0.3ml抗凝剂,混匀,200g离心力,离心10分钟,静置后吸取上层血浆,移到另一个离心管,经过二次离心,弃去上清层,吸取血浆下层制成富血小板血浆(PRP),分别进行相应指标检测。用Sysmex血细胞分析仪检测各组血小板计数等五项指标。用Nova biomedical血气分析仪测试各组的血糖、乳酸、渗透压及电解质、血气等指标。用光密度比浊法检测两组在二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP)、花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)及肾上腺素(Adrenaline,ADR)的诱导下,血小板在60s、180s、300s时的聚集度、最大聚集度和达到最大聚集度的时间;用血小板聚集仪测算低渗休克反应(Hypotonic shock response,HSR)的值。比较各组间血小板的各项指标的差异。研究结果对于同时采样的同一标本,肝素与枸橼酸抗凝的富血小板血浆都能达到满意的分离效果,血小板浓度约为全血血小板浓度的2-3倍,浓缩血小板的血小板计数值(platelet count,PLT)高于两组PRP。相比于EDTA抗凝,枸橼酸盐和肝素抗凝均会造成全血的血小板可逆性聚集,PLT、平均血小板体积(Mean platelet volume,MPV)、血小板体积分布宽度(Platelet volume distribution width,PDW)、大血小板比率(Platelet-large cell ratio,PLCR)和血小板压积(Platelet crit,PCT)均较低,与EDTA抗凝全血相比有显著性差异(P0.05)。当枸橼酸组与肝素组抗凝的血样加入EDTA抗凝剂后,PLT、MPV、PDW、PLCR和PCT均得到了不同程度的恢复,有显著性差异(P0.05)。肝素组PRP和枸橼酸组PRP的MPV与PDW均大于浓缩血小板,肝素组PRP的PDW大于枸橼酸组,差异有显著性(P0.05)。在体外循环(CPB)停机后,停机全血的PLT比CPB前全血的PLT显著下降(P0.05),PDW、PLCR和PCT在CPB后也明显降低(P0.05)。肝素组PRP的PH值高于与枸橼酸组PRP的值(P0.05),二氧化碳分压(Partial Pressure of Carbon Dioxide,PCO2)低于枸橼酸组 PRP(P0.01),碳酸氢根(Bicarbonate ion,HCO3-)则高于枸橼酸PRP组(P0.01)。与浓缩血小板组相比,肝素组的PH值要高一些(P0.05),HCO3-远大于浓缩血小板(P0.01);枸橼酸组的PH值高于浓缩血小板组(P0.05),PCO2和 HCO3-均大于浓缩血小板组(P0.01)。肝素PRP组与枸橼酸PRP组的PH值均高于其全血组(P0.01);肝素PRP组与枸橼酸PRP组的PCO2比起其全血组是降低的(P0.01)。两组抗凝剂的PRP之间和全血之间的PH值、PC02均有显著性差异(P0.01)。HCO3-也有统计学意义(P0.05)。和浓缩血小板组及枸橼酸组比较,肝素组钠离子(Na+)较低,钾离子(K+)、钙离子(Ca++)、镁离子(Mg++)和氯离子(Cl-)较高,差异有显著性(P0.01)。肝素组和枸橼酸组的血糖和乳酸均在正常范围,显著低于浓缩血小板组,有显著性差异(P0.01)。肝素组渗透压低于枸橼酸组和浓缩血小板组,有显著性差异(P0.01)。与浓缩血小板比较,两组PRP的低渗休克试验(Hypotonic shock response,HSR)恢复率均较高,有显著性差异(P0.01)。肝素PRP组与枸橼酸PRP组比较,无显著差异(P0.05)。肝素组AA和ADP的60s、180s、300s聚集率和最大聚集率均优于浓缩血小板组(P0.05)。枸橼酸组ADP和ADR在180s聚集率,AA、ADP和ADR的300s聚集率和最大聚集率均优于浓缩血小板组(P0.05)。肝素组PRP与枸橼酸组PRP相比,AA的60s聚集率、ADP的60s、180s、300s聚集率和最大聚集率均优于枸橼酸组PRP(P0.05)。结论:与EDTA抗凝相比,枸橼酸盐和肝素抗凝均会造成血小板可逆性聚集,但是这种聚集在加入EDTA后是可逆的。肝素组PRP的PDW、MPV、PLCR略大于枸橼酸组PRP和浓缩血小板组。CPB前全血的PLT、PDW、PLCR和PCT均优于停机全血。肝素组对多数离子的保存效果更接近生理水平,乳酸和血糖略高于其他组,但均在正常范围内。肝素PRP的PH值要高于枸橼酸组PRP和浓缩血小板组,这是由PC02和 HC03-的差异造成的。肝素PRP组对AA、ADP的聚集性优于枸橼酸PRP组,枸橼酸PRP组对ADR的聚集性更好,两组的AA、ADP、ADR聚集性均优于浓缩血小板组。两组PRP的低渗休克反应恢复率均较高,优于浓缩血小板组,肝素PRP组与枸橼酸PRP组比较,无显著差异。肝素可以作为心脏外科手术期间的血小板抗凝剂保存PRP。第二部分两组抗凝剂保存的富血小板血浆在不同时间点的质量变化研究目的第一部分对各种抗凝剂对PRP的保存效果做了比较。本阶段将进一步在离体状态下,评价以肝素抗凝和以枸橼酸抗凝的富血小板血浆在常温保存条件下随着时间延长,血小板质量的变化情况,并加入了电子显微镜下不同时间点的血小板形态指标,探索肝素抗凝的富血小板血浆在多长时间内对患者是安全有效的。研究方法2017年9月至2018年02月,选择本院20例拟行体外循环手术的成人患者作为研究对象,把同一患者同一时间抽取的静脉血分为枸橼酸抗凝组和肝素抗凝组。患者入室麻醉后,经颈内静脉置管抽取静脉血30ml分别注入多只枸橼酸抗凝管及肝素抗凝管内,每管各含2.7 ml全血以及0.3ml抗凝剂,混匀,以200g离心力,离心10分钟,静置后吸取上层血浆,移到另一个离心管,经过二次离心,弃去上清层,吸取血浆下层制成富血小板血浆,分别用离心管存储后,在取样的当时,取样后2小时、4小时、8小时、24小时这几个时间点进行相应指标的检测,包括两组的血小板计数等五项指标;两组的血糖、乳酸、渗透压及电解质、血气等指标;两组的低渗休克试验情况;两组在ADP、AA及ADR诱导下的最大聚集度。并用电镜观察血小板在取样当时和6小时后的形态和大小的变化。比较两组间血小板的各项指标的差异。研究结果两组PRP在各个时刻的PDW、MPV和PLCR均有显著性差异(P0.05)。与本组Oh 相比,SC-PRP 只有 4h 的 PDW、MPV 高于 Oh 的数值(P0.05);Heparin-PRP 的PDW的2h、24h与Oh相比有显著性差异(P0.05),MPV和PLCR的各个时刻均有显著性差异(P0.05),随着时间延长呈逐渐增大趋势。Heparin-PRP 在 Oh、2h、4h 的 PH 值高于 SC-PRP(P0.05)。SC-PRP 的 Na+、K+、Ca++、Mg++离子和乳酸值及渗透压在所有时刻与Heparin-PRP均有显著性差异(P0.05)。两组的血糖在0h、2h的差异有显著性(P0.05)。与本组Oh相比,两组的pH值均呈先增大后减少趋势,SC-PRP的PH值在全部时刻与Oh比较均有显著性差异(P0.05)。Heparin-PRP 的 Ca++在 2h、4h 与 8h 有下降(P0.05);血糖呈下降趋势,在8h和24h有显著性差异(P0.05);乳酸随着时间延长呈逐渐增大趋势(P0.05),但在8小时内,Heparin-PRP这几项生化指标均在正常范围内。SC-PRP的血糖在4h、8h和24h呈下降趋势(P0.05);乳酸随着时间延长呈逐渐增大趋势(P0.05)。SC-PRP 在 8h 的渗透压比 Oh 低(P0.05)。SC-PRP的AA和ADP的最大聚集率在多数时刻要低于Heparin-PRP(P0.05);ADR聚集率在Oh和2h高于肝素组(P0.05)。从4h开始,两组血小板的AA、ADP、ADR最大聚集率随着时间延长呈下降趋势,与本组0h相比均有显著性差异(P0.05),但在8小时以内的数值仍在正常范围内。两组低渗休克反应的HSR结果都在正常范围内,两组间在各个时刻无统计学差异(P0.05);组内随时间延长呈下降趋势,但在8h内组间差异不显著,24h时两组与Oh比较均有显著性差异(P0.05)。扫描电镜结果显示,Heparin-PRP的血小板体积稍大于SC-PRP和浓缩血小板组(P0.05),6h后组内比较差异不明显。两组血小板形态在Oh和6h的计分无明显差异。均比浓缩血小板组高。两组在6小时后伪足均增多,枸橼酸盐组的伪足更长更多。浓缩血小板组的伪足最多最长。透射电镜里,三组血小板的形态不尽相同。浓缩血小板组树突形的的血小板较多,伪足较多较长。枸橼酸血小板和肝素血小板呈圆盘状的血小板较多,伪足较少且短。透射电镜下的肝素血小板体积与其他两组无明显差异(P0.05)。结论Heparin-PRP的PDW、MPV和PLCR在各个时刻均稍高于SC-PRP,随着时间延长PDW、MPV和PLCR呈增大趋势。Heparin-PRP的PH值高于枸橼酸组,电解质均在生理范围内,各时刻的乳酸值均稍高于SC-PRP。SC-PRP的电解质含量异于正常值。随着时间延长,Heparin-PRP和SC-PRP的钙和血糖值均逐渐下降,乳酸逐渐增加,但在前8小时均在正常值内。Heparin-PRP在AA和ADP的最大聚集率要稍优于SC-PRP;而ADR的最大聚集率要低于SC-PRP。两组的HSR结果在各个时刻无统计学差异,组内随时间延长呈下降趋势,但在8h内组间无显著性差异。扫描电镜结果显示,Heparin-PRP的血小板体积稍大于SC-PRP的,两组血小板形态在Oh无明显差异,6h后两组的伪足均增多,浓缩血小板组的伪足最多最长。透射电镜的结果与之类似,浓缩组伪足较多较长,SC-PRP与Heparin-PRP组的圆形血小板较多,伪足较少。三组的直径大小无统计学差异,与扫描电镜结果不同。随着时间延长,Heparin-PRP各项指标与SC-PRP相比各有优劣,8小时内肝素的大部分指标都在正常范围内。Heparin-PRP在8小时内是相对安全的。
【图文】：
图２各种抗凝剂下血小板ＭＰＶ、ＰＤＷ柱形图逡逑３、两种富血小板血浆和浓缩血小板的参数、离子和代谢情况比较逡逑肝素与枸橼酸抗凝的富血小板血浆都能达到满意的分离效果，，血小板浓度约为逡逑全血血小板浓度２－３倍，血小板回收率两者无显著性差异。浓缩血小板丨３丨／丨’最高，逡逑
图３某个样品测量时的实时曲线逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R654.1
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