ASP8和叶酸双重修饰的阿霉素脂质体靶向治疗乳腺癌骨转移的实验研究

发布时间：2020-05-15 17:05

【摘要】：研究背景乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤疾病,发病后常转移到骨组织中,一旦发生转移将会导致较差的临床预后。由于骨骼细胞构成的特殊性,对化疗药物的摄取常常发生在非靶点区域,并在癌细胞和正常细胞中产生相似的细胞毒性。尽管学者们投入了大量的精力深入研究,但仍无法改变这一现状。因此,抑制癌细胞的侵袭性,有效控制癌细胞的转移,改善转移后的诊疗效果是我们努力的方向。临床上对乳腺癌骨转移的治疗方法主要集中在手术切除、内分泌治疗、化疗和放疗等方面。但由于骨骼特殊的病理生理特点,癌细胞在发生骨转移后,可选择的治疗方法有限,治疗效果并不理想,临床预后也较差。且骨转移通常是多发转移,因此通过局部放射治疗或外科手术治疗是难以彻底消除骨转移病灶。就化疗而言,由于骨骼内血循环流量低,全身用药难以在骨骼部位产生足量的药物浓度。为维持有效的化疗药物浓度,提高药物对骨骼转移病灶的治疗效果,通常需要加大药物剂量或者增加给药次数,二者均可能导致严重的全身性毒副反应。因此,设计一种具有高选择性和高效性的药物递送系统,将抗肿瘤药物更好地靶向运输至骨组织中的癌细胞,以获得更好的治疗效果,成为解决该临床问题的一大课题。本研究采用八天门冬氨酸(ASP8)和叶酸(FR)设计了双重修饰的阿霉素(DOX)脂质体递送药系统(A/F-LS),其中ASP8能够靶向骨组织,而叶酸则可进一步靶向骨组织中的肿瘤细胞,二者双重修饰可有效地将脂质体包裹的化疗药物递送至骨组织中的肿瘤细胞,并尽可能地减少正常细胞免受损伤。在试验中我们制备了DOX-A/F-LS,对其进行表征及密度优化,研究其药代动力学,在动物模型体内观察其对动物疼痛、动物生存期的影响及对体内细胞毒性等方面的作用;通过体外试验观察其对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响等方面。综合评估其对骨转移癌细胞的靶向治疗效果,研究结果为乳腺癌骨转移的临床治疗奠定实验基础。目的1.制备双重修饰的阿霉素脂质体,表征并优化其密度,以提高DOX-A/F-LS对MDA-MB-231细胞的选择性转运的靶向性。2.通过胫骨注射MDA-MB-231细胞建立乳腺癌骨转移小鼠模型,检测DOX-A/F-LS在动物体内的药代动力学、毒性和体内治疗功效。3.采用细胞外试验评价DOX-A/F-LS对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖周期的调节、迁移和侵袭能力的抑制作用及细胞外毒性,评价其抗肿瘤活性。方法1.双重修饰脂质体的制备与密度优化:通过合成DSPE-PEG2000-ASP8和DSPE-PEG2000-叶酸制备双重修饰的阿霉素脂质体;再对其进行表征;采用激光粒子分析仪检测各种脂质体的粒径大小;应用透析法检测各种脂质体制剂的药物释放;研究脂质体中不同浓度的ASP8与HA的结合效率,来确定ASP8与叶酸的最优配比。2.双重修饰脂质体细胞内治疗功效与毒性研究:通过胫骨注射MDA-MB-231细胞建立乳腺癌骨转移小鼠模型,分组按5mg/kg体重的等效剂量,自尾静脉分别注入游离阿霉素、阿霉素A-LS,阿霉素F-LS和阿霉素A/F-LS,研究其药代动力学;对小鼠体内成像进行检测;对动物疼痛行为进行评价;观察其体重变化及存活时间,从组织病理学和血象分析开展毒性研究,从而评估阿霉素A/F-LS的安全性。3.双重修饰脂质体细胞外毒性及靶向性研究:采用体外细胞试验的方法,建立细胞划痕实验及侵袭实验,对比研究阿霉素A/F-LS对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的抑制作用;并应用免疫印迹检测相关蛋白参与肿瘤相关信号通路的抑制作用;应用MTT法检测阿霉素A/F-LS对MDA-MB-231细胞生长周期的影响作用。结果1、实验合成了DSPE-PEG2000-ASP8和DSPE-PEG2000-叶酸功能复合物,观察到的质荷比约为3864.154和3239.984;制备了双重修饰的DOX-A/F-LS,采用激光粒子分析仪检测N-LS,A-LS,F-LS和A/F-LS的粒径大小大约在95.82±0.13nm和96.61±0.11nm之间,显示N-LS,A-LS,F-LS和A/F-LS的大小不因ASP8或叶酸修饰而受到明显影响。研究还显示ASP8修饰的脂质体(A-LS)与HA结合的能力,随着脂质体制剂中ASP8/脂质体摩尔比的增加,HA的结合量也显著增加,脂质体上DSPE-PEG2000-ASP8和DSPE-PEG2000-叶酸的最佳密度分别为15%和10%(摩尔比)。2、通过乳腺癌骨转移小鼠模型的尾静脉注射5mg/kg体重的等效剂量游离阿霉素、阿霉素A-LS,阿霉素F-LS和阿霉素A/F-LS,在注射后0.083、0.25、0.5、1,2,3、4,6,8、12和24小时从颈静脉抽取血样,显示脂质表面结合足够量的ASP8和叶酸并不会损害PEG的体循环特性;活体成像获得的数据表明A/F-LS系统有可能在细胞内实现药物对转移骨肿瘤细胞的特异性靶向转运。在接种肿瘤细胞后的第4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24天检测小鼠疼痛相关的行为,A/F-LS治疗组可显著减少动物退缩次数(3.25±0.63),可有效减轻动物疼痛水平。组织学和血液学的检测指标表明,A/F-LS组只有轻微的肝脏毒性,红细胞(RBC)和白细胞(WBC)水平没有明显下降,显示A/F-LS在很大程度上减轻了DOX的细胞毒性,并且在测试剂量下相对安全。在整个实验期间A/F-LS组小鼠的体重减轻值均小于游离DOX组,延长动物中位生存时间(27天),表明DOX-A/F-LS可通过骨靶向递送减少非特异性细胞对其摄取,通过增强肿瘤细胞对其内吞摄取而表现出更强的抗肿瘤活性。3、细胞外DOX-A/F-LS处理MDA-MB-231细胞72h后,流式细胞仪检测DOX-A/F-LS组S期细胞显著降低,其中DOX-A/F-LS 1u M和10u M处理组S期细胞占比分别为18.98±8.84,13.00±7.14,明显低于对照组32.56±7.29。细胞划痕实验显示DOX-A/F-LS(10u M)组实验细胞划痕愈合率为50.36±1.1%,明显低于空白对照组的79.89±1.60%(P0.05),表明DOX-A/F-LS对MDA-MB-231细胞转移侵袭能力有显著抑制作用。Transwell实验与对照组对比,结果显示DOX-A/F-LS组能有效抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力,高浓度处理组抑制效果更明显,有显著的迁移和侵袭抑制效应。免疫印迹实验检测p-ERK1/2、p-Akt,p-p38蛋白表达情况,结果显示DOX-A/F-LS处理组可以显著抑制ERK1/2、AKT的磷酸化水平,而对于p-p38没有影响,提示AKT和ERK1/2参与了阿霉素脂质体对于MDA-MB-231细胞增值和迁移的抑制效应。MTT方法检测含有DOX的脂质体制剂对细胞外MDA-MB-231细胞毒性,DOX-F-LS和DOX-A/F-LS的IC50值分别为17.8lμg/m L和15.3μg/m L,明显低于对照组IC50值的100.5μg/m L和94.9μg/m L。结果表明,经过叶酸修饰后的阿霉素脂质体可显著抑制细胞表面叶酸受体过表达的MDA-MB-231细胞增殖,有助于将药物进一步转运至骨组织中的肿瘤细胞,增强对骨转移肿瘤的治疗效果。结论1.DOX-A/F-LS的粒径大小大约在95.82±0.13nm和98.61±0.11nm之间,脂质体上ASP8和叶酸的最佳密度分别为15%和10%(摩尔比),可有效提高药物转运的主动靶向性,降低内在超越依赖的EPR效应。2.DOX-A/F-LS是理想的乳腺癌骨转移药代动力学模型,适用于通过全身给药对MDA-MB-231细胞的靶向药物递送,减少对健康细胞的毒性。3.DOX-A/F-LS在乳腺癌骨转移进程中能有效调节MDA-MB-231细胞的增殖周期,显著抑制癌细胞转移和侵袭能力作用,可有效的发挥抗肿瘤作用。
【图文】：

游离巯基,功能结合,偶联,位点

修饰而来的。这两种功能物质合成过程如图1所示。用半胱氨酸终止ASP8以引入游离巯基（-SH），然后通过巯基-马来酰亚胺反应与DSPE-PEG2000-Mal偶联，这使得ASP8能够在特定位点（-SH）缀合（图1-1 A）。为了制备DSPE-PEG2000-叶酸，我们通过碳二亚胺介导与叶酸偶联先制备成DSPE-PEG2000-NH2（图1-1 B）。MALDI-TOF MS结果证实了成功合成了DSPE-PEG2000-ASP8和DSPE-PEG2000-叶酸，观察到的质荷比约为3864.154和3239.984（图1-1 C 和图1-1 D，由箭头标记），理论质荷比分别为3864和3239，然后将最终产物用于制备N-LS、A-LS、F-LS和A/F-LS的靶向脂质体。图1-1 靶向脂质体功能结合物合成（A）:引入游离巯基（-SH）与DSPE-PEG2000-Mal偶联，ASP8在特定位点（-SH）缀合；（ B ） : 以碳二亚胺介导与叶酸偶联制备成 DSPE-PEG2000-NH2 ；（C-D）:MALDI-TOF MS结果证实合成功能结合物，观察质荷比。4.2 脂质体的表征表1-1总结了四种不同脂质体制剂的理化性质。所有脂质体的EE（%）值最小在91.7 ± 1.2；最大值在94.5 ± 1.8，四个类型脂质体的EE（%）值均大于90%

脂质体,图像检测,透射电子显微镜,粒径

空军军医大学博士学位论文-39-也与使用激光粒子分析仪测定的粒径相似，见图1-2（B）。表明双重修饰后的脂质体不会影响药物递送系统的作用发挥，也不会改变其在体内、体外被摄取，吸附在血管内外和药物的释放，从而保证其稳定性。图1-2 脂质体表征及药物释放性能（A）通过透射电子显微镜观测 A/F-LS 形态及分布；（B）应用 TEM 图像检测粒径大小与激光粒子分析仪测定的比较；（C）采用透析法检测各种脂质体制剂的药物体外释放；（D）A/F-LS 用含有 10%FBS 的细胞培养 48 小时评估脂质体在 10%FBS 中的体外稳定性。4.3 脂质体药物的释放图1-2（C）显示的是采用DOX释放试验以检测脂质体的药物释放性能，结果显示，，N-LS，A-LS，F-LS和A/F-LS四种脂质体放入含有0.5%Tween-80（w/w）的磷酸盐缓冲溶液介质的透析袋中，在1/2小时、1小时、2.5小时、5小时、7.5小时,10小时等各个时间点
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9;R738

【参考文献】