多层PLGA支架联合PRP修复兔膝关节骨软骨缺损的实验研究
发布时间：2020-05-16 11:34
【摘要】：由于关节软骨和软骨下骨及其交界处的组织学结构存在不同,仿生设计符合骨软骨及其交界处组织细胞再生需要的支架可能是实现骨软骨一体化重建的一项重要研究内容。研究逐渐证实了富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)在骨、软骨、韧带等组织再生方面的积极作用,研究证实PRP促进软骨下骨内的祖细胞的迁出和成软骨分化;还可促进间充质干细胞增殖并向成软骨细胞分化;PRP联合间充质干细胞则可以形成骨组织。PRP的液态特征决定了其存在缺乏机械强度的弱点。如果PRP可与人工合成的不同孔径的多层层PLGA支架和具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞联合构建细胞/支架复合体,探讨多层的一体化PLGA支架的细胞接种方法的适用性和高效性,并将其置于关节部位骨软骨缺损模型,可能会更加有利于骨与软骨的再生修复,对后续相关研究也具有一定的借鉴意义。通过优化设计多层PLGA支架可能利于寻求一种更高仿生度的骨软骨支架用于骨软骨缺损的组织工程修复技术方法。实验目的:1.制备无孔粘合层PLGA支架。PLGA支架上层为软骨层,中间的模拟骨软骨交界层PLGA膜和下层的骨段。上层和下层为多孔结构。实验制备膝关节软骨及软骨下骨缺损。制备自体PRP,并将其加载于无孔粘合层PLGA支架,构建PLGA/PRP复合体及关节腔内注射PRP修复膝关节骨软骨缺损动物模型。通过相关检测以探讨无孔粘合层PLGA以及PRP在新西兰兔骨软骨缺损模型修复中效应;初步阐明PRP在修复兔膝关节骨软骨缺损模型中的作用。2.通过采集新西兰兔骨髓获得骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells BMSCs),与无孔粘合层的多层PLGA支架构建PLGA/BMSCs复合体,初步探索分次离心接种法在无孔粘合层PLGA支架接种的可行性以及BMSCs在体内环境中诱导成软骨及成骨的效应。3.通过调整PLGA支架粘合层的孔径,获得多孔粘合层PLGA支架和无孔粘合层PLGA支架,初步探讨比较多孔粘合层PLGA支架和无孔粘合层PLGA支架联合PRP关节腔内注射在骨软骨缺损修复中的效果差异。试验方法1.PGA和PLG材料(75:25)溶于二氯甲烷后与NaCl晶体致孔剂混合均匀。置入支架模具、模压成形、支架脱模获得无孔粘合层PLGA支架,分别有上层0.3mm的软骨层,中间层厚度0.3mm PLGA膜和下层3.4mm的骨段。孔隙率均为92%,软骨层和骨段的孔径分别为50-100μm和300-450μm。离心法制备PRP;并制备PLGA/PRP复合体;制备骨软骨缺损(直径4mm、深度4mm)模型。实验组(PLGA加载PRP+关节腔注射PRP)、对照组1(空白PLGA植入组)、对照2组(缺损组的关节腔注射PRP)。在术后4周、12周、24周大体形态学、组织学、Q-PCR 方法进行 Collagen type Ⅱ、Aggrecan、Collagen type Ⅰ、Collagen type X的表达、Micro-CT扫描评估。2.实验动物骨髓获得原代BMSCs,贴壁培养、传代,利用三代BMSCs作为种子细胞。分次离心方法将细胞接种与无孔粘合层PLGA支架的软骨层和成骨段,电镜扫描细胞粘附情况,小动物成像检测细胞在PLGA支架内的分布。PLGA/BMSCs复合体及PRP关节腔注射。术后12周大体形态、组织学、Q-PCR、Micro-CT扫描予以评估。3.制备多孔粘合层PLGA支架,中间的多孔结构为孔径为100-150μm,制备中间层多孔粘合层PLGA支架。电镜扫描观察粘合层结构。制备PLGA/PRP复合体+PRP关节腔注射、术后4周、12周、24周进行大体外观、组织学、Micro-CT扫描等评估多孔粘合层和无孔粘合层PLGA支架。实验结果1.获得实验所需的无孔粘合层PLGA支架。PRP中的血小板浓度为1648.19±76.84x103/μl,血小板浓度为制备前全血中血小板浓度的5.1倍。大体评分:各时间点(4w、12w、24周)PLGA/PRP+PRP注射组评分均高于PLGA组和PRP注射组(p0.05)。组织学评估:各时间点(4w、12w、24周)PLGA/PRP组的评分均高于PLGA组和PRP注射组,Ⅱ型胶原表达以PLGA/PRP+PRP组的阳性表达最为明显。Q-PCR检测:各时间点(12w和24w)的Ⅱ型胶原和aggrecan表达 PLGA/PRP+PRP 组高于 PRP 注射组。Micro-CT 扫描:12w:PLGA/PRP+PRP注射组 BV/TV 为(20.50±1.29)%,PRP 注射组和 PLGA 组为(15.75+1.71)%和(17.0±2.94)%。PLGA/PRP+PRP 组的 BV/TV 值明显高于另两组(P=0.000)。24w:PLGA/PRP+PRP 注射组 BV/TV 为(42.25±2.63)%,PRP 注射组和 PLGA组为(34.75±5.73)%和(28.75±5.96)%。2.细胞培养与接种:软骨层和成骨段离心接种细胞的百分比及接种细胞数量分别为(83.5±2.20)%、(80.5±2.50)%和 3.34x105/ml、3.22x106/ml。电镜观察与荧光标记证实材料内部有大量细胞存在并粘附。大体评估:术后12周,PLGA/BMSCs复合体植入联合PRP关节内注射后的缺损修复得分为14±0.58。组织学评估:PLGA/BMSCs复合体植入联合PRP关节内注射组的组织学评分为21.80±0.58。Micro-CT 扫描:PLGA/BMSCs 复合体+PRP 注射组的 BV/TV 为(30.0±3.37)%。3.获得具有多孔与无孔粘合层两种不同规格的多层PLGA支架。软骨段孔径50-100μm,骨段的孔径为300-450μm;粘合层分别为孔径100-150μm多孔结构和无孔的PLGA膜结构。大体评估:4w:无孔粘合层组10.67±0.58,多孔粘合层组10.33±0.58;12w:无孔粘合层组13.67±0.58,多孔粘合层组13.33±0.58;24w:无孔粘合层组11.67±0.58,多孔粘合层组12.33±0.58。在4w和12w时两组评分无明显差异。组织学评估:组织学评分:4w:无孔粘合层组14.00±1.00,多孔粘合层组13.33±0.58;12w:无孔粘合层组15.67±0.58,多孔粘合层组15.67±0.58;24w:无孔粘合层组得分22.67±0.58,多孔粘合层组21.67±0.58。两组无明显差异(P=0.101)。Ⅱ型胶原相对表达水平检测结果发现随着随访时间的推移,Ⅱ型胶原由缺损边缘逐渐向中心区域增多,分布均匀,两组趋势基本一致。Micro-CT扫描:12w和24w,无孔粘合层PLGA组与多孔粘合层PLGA组的软骨下骨的区域底部及周缘存在矿化组织,中心区域矿化组织较少。实验结论:1.关节腔注射PRP可促进关节软骨及软骨下骨缺损再生修复;无孔粘合层PLGA支架加载自体PRP联合RPP关节腔注射对关节软骨及软骨下骨缺损再生修复作用进一步增强。2.分次离心接种法是一种适合无孔粘合层PLGA支架的细胞接种方法,接种效率较高;无孔粘合层PLGA支架联合自体BMSCs和PRP可进一步增强软骨下骨缺损区域的新生组织的矿化能力。3.无孔粘合层PLGA和多孔粘合层PLGA支架联合PRP关节腔注射均具有促进关节软骨缺损的再生修复;PLGA无孔粘合层降解较慢,PLGA多孔粘合层早期阶段的机械支撑强度欠佳,容易塌陷,PLGA粘合层需要进一步优化;多孔PLGA支架成骨段需优化以增强骨再生能力。
【图文】：
逦第一章多层ＰＬＧＡ／ＰＲＰ复合体联合ＰＲＰ注射修复兔膝关节骨软骨缺损模型逡逑图１－１富血小板血浆的制备流程图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｐｌａｔｅｌｅｔ邋ｒｉｃｈ邋ｐｌａｓｍａ邋ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｃｅｓｓ．逡逑１．５．３富血小板血浆（ＰＲＰ）激活逡逑ＰＲＰ激活方法参照ＩｓｈｉｄａＫ等研宄中所述方法［２３］。按照２０：１的比例在制备逡逑的ＰＲＰ中加入ＣｌＣａ２／激活时间点为充分浸润ＰＬＧＡ后３０ｍｉｎ。逡逑１．５．４邋ＰＬＧＡ支架的ＰＲＰ加载与植入逡逑将前述灭菌风干备用的ＰＬＧＡ支架置入６孔板内，每孔１例。使用移液器向逡逑板孔内加入前述激活的；ＰＲＰ液体，使ＰＬＧＡ完全浸入并浸泡ｌＯｍｉｎ。将加载ＰＲＰ逡逑的ＰＬＧＡ支架在术中利用显微镊子小心夹取以避免支架变形，将其植入己制备逡逑的股骨内髁骨软骨圆柱状缺损处。逡逑■＾＂？｜！！！！！１１＼R蒎义贤迹保插澹校蹋牵林Ъ芗釉馗谎“逖义希疲椋纾酰颍邋澹保插澹校蹋牵铃澹螅悖幔妫妫铮欤洌箦澹欤铮幔洌澹溴澹穑欤幔簦澹欤澹翦澹颍椋悖桢澹穑欤幔螅恚徨义希保担凳笛槎锓肿殄义辖常吨唤】敌挛骼及淄盟婊治匙椋直鹞笛樽椋ǎ校蹋牵良釉兀校遥校劐义辖谇蛔⑸洌校遥校⒍哉兆椋卞澹ǹ瞻祝校蹋牵林踩胱椋⒍哉眨沧椋ㄈ彼鹱榈墓亟谇蛔㈠义仙洌校遥校孔椋保独ㄈ绫恚保保ｅ义希保村义
本文编号：2666677
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