粒细胞集落刺激因子（G-CSF）介导金黄色葡萄球菌骨髓炎中骨量丢失及机制研究

发布时间：2020-05-16 23:31

【摘要】：目的:探讨粒细胞集落刺激因子介导金黄色葡萄球菌感染引起的骨量下降的关联性及其机制方法:1、金黄色葡萄球菌性慢性骨髓炎模型的建立及验证:白细胞计数、细菌培养、X线摄影、磁共振检查等相关的验证;2、金黄色葡萄球菌感染引起成骨能力下降导致骨量丢失:(1)Micro-CT扫描检测骨组织并对相关参数进行分析;(2)对骨组织样本中成骨和破骨相关基因表达进行q-PCR检测;(3)成骨能力检测:骨钙素(OCN)免疫组化染色;(4)破骨能力检测:抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。3、G-CSF抗体能够缓解金黄色葡萄球菌感染引起的骨量丢失:(1)生物信息学方法筛选与骨量下降相关的炎性因子;(2)临床慢性骨髓炎患者血清G-CSF的ELISA检测;(3)小鼠血清及骨髓上清G-CSF的ELISA检测;(4)骨组织内单核巨噬细胞免疫组化检测;(5)G-CSF抗体注射后骨组织Micro-CT扫描检测;(6)G-CSF抗体注射后白细胞计数;(7)G-CSF抗体注射后骨组织OCN免疫组化检测。4、G-CSF引起骨量丢失的机制研究:(1)小鼠前成骨细胞提取和培养;(2)G-CSF处理前成骨细胞后相关成骨标志q-PCR检测;(3)前成骨细胞茜素红(Alizarin Red)染色检测;(4)Western Blot 检测成骨相关 Wnt/β-catenin通路及BMP/Smd1通路。结果:1、金黄色葡萄球菌性慢性骨髓炎模型的建立及验证:(1)我们的结果发现在第1、2、3周白细胞计数显著高于对照组,差异具有统计学意义(p0.05)。而在第4、5周时白细胞下降,与对照组相比,差异无统计学意义;(2)X线摄影检查结果显示注射细菌14天时,在与尾静脉注射部位(鼠尾1/3处)相近的髂骨及尾骨出现了提示病灶存在的高密度影;(3)磁共振检查结果显示:胫骨髓腔内已经出现了异常的信号影;(4)细菌培养鉴定结果为试验用金黄色葡萄球菌。2、金黄色葡萄球菌感染引起成骨能力下降导致骨量丢失:(1)MicroCT相关骨组织参数:骨体积分数(BV/TV),骨小梁数量(Tb/N),骨小梁厚度(Tb/Th),连接密度(Con.D)均下降;以及骨小梁间隔(Tb/Sp),骨小梁模式因子(Tb.Pf)均升高;(2)成骨相关基因选择骨钙素(OCN)和RUNX2,q-PCR结果显示OCN、RUNX2的表达显著下降,而RANKL的表达无显著改变;(3)感染组的OCN阳性成骨细胞数量显著低于对照组的数量;(4)与对照组相比,金黄色葡萄球菌感染组内抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性的破骨细胞数量有所增加,但是差异没有统计学意义。3、G-CSF抗体能够缓解金黄色葡萄球菌感染引起的骨量丢失:(1)我们发现粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)在所有炎性因子中变化趋势最大;(2)金黄色葡萄球菌性慢性骨髓炎患者血清中的G-CSF含量要显著高于健康对照组;(3)动物感染模型的ELISA结果证实在血清及骨髓上清中的G-CSF都显著升高,尤其在骨髓腔内G-CSF大量表达;(4)F4/80抗体的免疫组化试验发现分泌G-CSF的骨髓腔内单核巨噬细胞的数量也显著增加;(5)中和G-CSF以后,感染后骨量下降能够被部分逆转。4、G-CSF引起骨量丢失的机制研究:(1)q-PCR:与对照组相比,随着G-CSF浓度的升高RUNX2、ALP以及Osterix的表达倍数由升高变为降低,即低剂量10 ng/mL组具有促进RUNX2、ALP以及Osterix表达的作用,随着浓度增加,50 ng/mL组的促进作用下降,到100 ng/mL浓度时显著抑制RUNX2、ALP以及Osterix的表达;(2)茜素红染色(Alizarin Red)结果显示:与对照组相比,随着G-CSF浓度的升高矿化结节数由升高变为降低,即低剂量10 ng/mL组具有促进前成骨细胞矿化,结节数量增加,随着浓度增加,50 ng/mL组的促进矿化作用下降,到100ng/mL浓度时抑制前成骨细胞的矿化;(3)G-CSF能够通过抑制成骨相关的Wnt/β-catenin和BMP/Smd1信号通路,从而抑制成骨细胞的成骨分化能力。结论:G-CSF可能通过抑制成骨相关的Wnt/β-catenin及BMP/Smd1这两条信号通路抑制前成骨细胞向成骨细胞分化,介导了金黄色葡萄球菌感染引起的骨量下降。
【图文】：

白细胞计数,时间点

博士论文果分析逡逑据对感染造模以后１、２、３、４、５周这五个时间的白细胞计数进，我们发现在第１、２、３周白细胞计数显著高于对照组，差异具有＜０．０５）。而在第４、５周时白细胞下降，与对照组相比，差异无统组在这五个时间点的白细胞计数值无明显波动，无统计学差异。：在感染第一周白细胞升高，在第二周时白细胞计数水平达到始下降，直至第四周基本恢复正常对照组水平。逡逑＾

胫骨,小鼠,金黄色葡萄球菌,磁共振检查

对照组逦Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染组逡逑图１－２造模后１４天Ｘ线影像表现逡逑３．２磁共振检查逡逑同时，在金黄色葡萄球菌注射１４天后，我们用活体小动物磁共振成像系统逡逑对小鼠胫骨进行检查，结果显示，，所有金黄色葡萄球菌注射组均发现胫骨髓腔逡逑内（不同小鼠出现在左侧或右侧，或者同时存在）出现信号改变，这提示炎症逡逑的存在。而对照小鼠胫骨髓腔内信号较一致，无明显炎症性改变。逡逑对照组逦Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染组逡逑图１－３造模后１４天核磁共振影像改变逡逑４．细菌涂皿培养及鉴定结果逡逑我们取股骨的髓腔内容物进行琼脂平板培养，在３７°Ｃ恒温孵箱培养２４小时逡逑１２逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.2

【参考文献】