股骨头TNF-α含量及表观学修饰调控TNF-α对BMMSCs成骨分化影响的作用机制研究

发布时间：2020-05-17 21:31

【摘要】：目的:研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)在坏死股骨头内的表达水平以及TNF-α对SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法:1.从手术中获取股骨头坏死患者的股骨头,采用酶联免疫夹心法(ELISA法)测定股骨头内正常骨、硬化骨及坏死骨内TNF-α的含量,并分析三种骨内TNF-α含量的差异,及硬化骨内含量变化与患者年龄、性别、病因、证型、疼痛时间、ARCO分期和JIC分型之间的相关性。2.提取SD大鼠骨髓间充质干细胞,体外常规培养、传代至第4代进行实验。在不同浓度TNF-α干预下,成骨诱导培养基培养骨髓间充质干细胞的第14天、第21天分别进行ALP染色、ALP活性测定、茜素红染色和钙盐沉积定量测定,观察不同浓度TNF-α对SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响,根据染色结果,确定作用最明显的TNF-α浓度,并在此浓度干预骨髓间充质干细胞的第5天提取细胞RNA和蛋白,分别进行实时荧光定量PCR和Western-blot实验,分析TNF-α对成骨分化相关基因和蛋白的影响;干预的第5天提取基因组DNA,分析干预前后Runx2启动子区CpG岛DNA甲基化水平的变化;在干预的第5天,进行染色质免疫共沉淀实验,分析组蛋白H3K4和H3K27甲基化水平的变化。结果:1.共获取60例股骨头坏死患者的股骨头,男性45例,女性15例,平均年龄48.88±12.98岁;60例患者正常骨TNF-α含量90.66±40.29pg/ml,硬化骨TNF-α含量122.61±45.84pg/ml,坏死骨TNF-α含量65.79±34.79pg/ml;45例男性患者正常骨TNF-α含量88.74±36.89pg/ml,硬化骨TNF-α含量128.02±46.67pg/ml,坏死骨TNF-α含量65.91±35.55pg/ml,15例女性正常骨TNF-α含量96.42±50.16pg/ml,硬化骨TNF-α含量106.39±40.48pg/ml,坏死骨TNF-α含量65.43±39.53pg/ml;年龄段18-35岁14例,坏死骨TNF-α含量90.87±39.54pg/ml,硬化骨TNF-α含量104.93±35.11pg/ml,坏死骨TNF-α含量61.27±35.39pg/ml,年龄段36-50岁18例,正常骨TNF-α含量88.65±34.29pg/ml,硬化骨TNF-α含量126.44±31.03pg/ml,坏死骨TNF-α含量69.67±28.99pg/ml,年龄段50岁28例,正常骨TNF-α含量91.84±45.27pg/ml,硬化骨TNF-α含量128.99±56.38pg/ml,坏死骨TNF-α含量65.55±38.62pg/ml;特发性坏死、肝肾亏虚型8例,正常骨TNF-α含量99.18±40.45pg/ml,硬化骨TNF-α含量130.87±43.29pg/ml,坏死骨TNF-α含量77.00±31.13pg/ml,激素性坏死、肾虚血瘀型18例,正常骨TNF-α含量93.10±42.68pg/ml,硬化骨TNF-α含量129.34±54.82pg/ml,坏死骨TNF-α含量70.19±37.37pg/ml,酒精性坏死、痰瘀蕴结型29例,正常骨TNF-α含量88.87±39.02pg/ml,硬化骨TNF-α含量121.82±41.51pg/ml,坏死骨TNF-α含量64.73±35.11pg/ml,创伤性坏死、气滞血瘀型5例,正常骨TNF-α含量78.62±47.92pg/ml,硬化骨TNF-α含量89.74±34.47pg/ml,坏死骨TNF-α含量38.19±17.11pg/ml;疼痛时间0-12个月33例,正常骨TNF-α含量91.24±42.93pg/ml,坏死骨TNF-α含量124.87±51.05pg/ml,硬化骨TNF-α含量67.92±37.73pg/ml,疼痛时间13-24个月11例,正常骨TNF-α含量105.19±37.57pg/ml,硬化骨TNF-α含量115.21±45.55 pg/ml,坏死骨TNF-α含量68.76±34.44pg/ml,疼痛时间24个月16例,正常骨TNF-α含量79.48±34.96pg/ml,硬化骨TNF-α含量123.05±35.66pg/ml,坏死骨TNF-α含量59.35±29.53pg/ml;ARCOIIIA期6例,正常骨TNF-α含量95.36±34.22 pg/ml,49.77±20.50pg/ml,73.81±31.09pg/ml,ARCOIIIB 31例,正常骨TNF-α含量92.27±43.04pg/ml,硬化骨TNF-α含量128.79±50.32pg/ml,坏死骨TNF-α含量68.84±37.87pg/ml,ARCOIIIC 9例,正常骨TNF-α含量104.11±43.99pg/ml,硬化骨TNF-α含量117.43±45.69pg/ml,坏死骨TNF-α含量69.99±38.82pg/ml,ARCOIV 14例,正常骨TNF-α含量76.42±32.99pg/ml,硬化骨TNF-α含量100.62±35.74pg/ml,坏死骨TNF-α含量52.89±25.32pg/ml;JIC C1型35例,正常骨TNF-α含量96.96±42.00pg/ml,硬化骨TNF-α含量126.16±47.94pg/ml,坏死骨TNF-α含量71.14±36.35pg/ml,JIC C2型25例,正常骨TNF-α含量81.82±36.76pg/ml,硬化骨TNF-α含量117.64±43.21pg/ml,坏死骨TNF-α含量58.29±31.67pg/ml。通过单因素方差分析,正常骨、硬化骨和坏死骨TNF-α含量与患者性别、年龄(18-35岁、36-50岁、50岁)、病因(特发性、激素性、酒精性、创伤性)、证型(肝肾亏虚、肾虚血瘀、痰瘀蕴结、气滞血瘀)、疼痛时间(0-12月、13-24月、24月)、ARCO分期(IIIA、IIIB、IIIC、IV)、JIC分型(C1、C2)均无相关性(P0.05);通过多个因素的二分类Logistic回归分析,坏死股骨头内硬化骨TNF-α含量与患者性别、年龄(18-35岁、36-50岁、50岁)、病因(特发性、激素性、酒精性、创伤性)、证型(肝肾亏虚、肾虚血瘀、痰瘀蕴结、气滞血瘀)、疼痛时间(0-12月、13-24月、24月)、JIC分型(C1、C2)均无相关性(P0.05),而与ARCO分期(IIIA、IIIB、IIIC、IV)有相关性(P=0.0490.05),优势比为0.381,即股骨头坏死ARCO分期每增加一期,股骨内硬化骨TNF-α含量就会增加0.381倍。2.提取的SD大鼠干细胞形态呈长梭形,具有多向分化潜能,能够向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化,明确提取的是SD大鼠骨髓间充质干细胞;不同浓度TNF-α(10pg/ml、100pg/ml、1000pg/ml和10000pg/ml)不会影响干细胞的活性;ALP染色和茜素红染色结果显示,10pg/ml和100pg/ml对SD骨髓间充质干细胞的成骨分化无明显影响,而1000pg/ml和10000pg/ml TNF-α则会抑制SD骨髓间充质干细胞的成骨分化,且浓度10000pg/ml抑制作用最明显。实时PCR结果显示,10000pg/ml浓度TNF-α会明显下调成骨分化相关基因Runx2、ALP和OPN的表达;Western-blot结果显示10000pg/ml浓度TNF-α会明显抑制Runx2蛋白的表达;对照组Runx2启动子中总Cp G基因座中甲基化Cp G基因座的百分比为3.33%,而TNF-α处理组Runx2启动子中总Cp G基因座中甲基化Cp G基因座的百分比为9.05%,TNF-α干预后Runx2启动子区Cp G岛甲基化水平明显升高;染色质免疫共沉淀结果显示,10000pg/ml浓度TNF-α干预SD骨髓间充质干细胞,会明显抑制组蛋白H3K4的三甲基化,同时明显促进组蛋白H3K27的三甲基化。结论:股骨头坏死患者股骨头内正常骨、硬化骨和坏死骨内TNF-α含量存在明显差异,以硬化骨TNF-α含量最高,且含量与患者性别、年龄、病因、证型、疼痛时间、ARCO分期及JIC分型均无相关性,但是JIC分型是影响硬化骨TNF-α含量的危险因素;高浓度TNF-α(1000pg/ml和10000pg/ml)会抑制SD骨髓间充质干细胞的成骨分化,通过增加Runx2启动子区Cp G岛甲基化水平、促进组蛋白H3K27的三甲基化及抑制组蛋白H3K4的三甲基化是TNF-α影响SD骨髓间充质干细胞的成骨分化的作用机制之一。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.8

【参考文献】

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4 张璐;邹红云;余伍忠;王铮;焦敏;;强直性脊柱炎患者TNF-α表达水平测定分析[J];中国实验诊断学;2014年04期

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6 陈镇秋;何伟;魏秋实;;股骨头坏死中医证型与血液学指标的关系研究[J];中医正骨;2013年03期

7 汤荣华;黄建军;;类风湿性关节炎患者血清GM-CSF、IL-6、IL-17和TNF-α的水平测定及临床意义[J];检验医学;2013年03期

8 赵德伟;胡永成;;成人股骨头坏死诊疗标准专家共识(2012年版)[J];中华关节外科杂志(电子版);2012年03期

9 段瑞奇;何伟;;中医辨病辨证在治疗股骨头坏死中的应用[J];新中医;2010年08期

10 罗翔军;;运用中医理论和中药辩证论治股骨头坏死临床随笔[J];中外医疗;2009年33期

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本文编号：2669209