通过抑制microRNA-204促进神经元自噬和调节凋亡在脊髓缺血再灌注损伤早期的实验研究

发布时间：2020-05-18 13:02

【摘要】：目的脊髓缺血再灌注损伤是心血管外科手术后发生率较高、较为严重的并发症之一,目前的预防和治疗手段有限,寻找新的方法势在必行。自噬是新近研究的热点,它在细胞代谢及组织损伤修复等病理生理过程中发挥重要作用。microRNAs是在真核生物中发现的一类非编码单链的RNA分子,不仅与多种疾病的发生密切相关并且还参与调控包括自噬在内的诸多病理生理过程。microRNA-204在脊髓缺血再灌注损伤早期就有明显表达而且与自噬关系密切,而脊髓损伤早期是神经元细胞修复治疗的黄金时期,故本实验以microRNA-204作为分子靶点,观察在大鼠脊髓缺血再灌注损伤早期,抑制microRNA-204的表达后对大鼠后肢运动神经功能的影响,着力从自噬与凋亡方面研究其相关的分子机制,旨在探索脊髓神经保护的新策略。研究方法随机选取体重250g左右的雄性SD大鼠50只,分为假手术组、缺血再灌注6小时、12小时、24小时及48小时组(n=10),除假手术组外,其他各组均采用开胸阻断左锁骨下动脉远端胸降主动脉14min的方法建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型,分别于再灌注6小时、12小时、24小时,48小时对各组大鼠进行运动神经功能进行评分(MDI运动功能评分法),评分后取脊髓标本分别进行:HE染色,观察再灌注后不同时间点大鼠脊髓组织病理学变化;电镜下观察脊髓损伤后神经元细胞自噬的发生及自噬体的形态;免疫组化检测自噬特异性蛋白LC3II的表达;western-blot检测自噬特异性蛋白LC3、Beclin 1及microRNA-204的靶蛋白bcl-2的表达;qRT-PCR检测大鼠microRNA-204的表达。另取雄性SD大鼠60只,随机分为6组。假手术组(sham组):开胸不阻断胸降主动脉;对照组(control组):开胸阻断胸降主动脉14 min;空白对照病毒载体组(vector组):鞘内注射10μl空白慢病毒载体(1×10~7TU),5天后开胸阻断胸降主动脉14 min;抑制microRNA-204组(antagomiRNA-204组):利用H1-MCS-CMV-EGFP构建lentivirally expressed antagomiRNA-204载体,鞘内注射10μl含有antagomiRNA-204的慢病毒载体(1×10~7TU)进行大鼠脊髓基因转染,抑制大鼠脊髓microRNA-204的表达,5天后开胸阻断胸降主动脉14 min;抑制自噬组(3-MA组):鞘内注射自噬抑制剂3-MA(100μg溶于2μl生理盐水)后阻断主动脉14min;抑制microRNA-204+抑制自噬组(antagomiRNA-204+3-MA组):鞘内注射10μlantagomiRNA-204,浓度1×107TU/ml,5天后处理同3-MA组。于再灌注6、12、24、48小时分别对6组动物进行后肢运动功能评分(MDI),于48小时后处死动物,取腰4-6节段脊髓组织进行HE染色并计数健存神经元数,TUNEL染色并计数凋亡细胞,western blot检测凋亡蛋白caspase-3的表达的改变。另取6组动物(n=4)进行平行实验,于再灌注6小时处死动物取腰4-6节段脊髓组织,qRT-PCR检测microRNA-204的表达,western blot检测bcl-2、Beclin-1、LC3-II蛋白的表达。结果1、大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型效果确切。在脊髓缺血再灌注损伤模型中,缺血再灌注后6、12、24、48小时4个时间点各组的运动神经功能评分较假手术组明显增加,差异有统计学意义(P0.05),同时HE染色下可见不同程度神经元细胞肿胀、坏死,尼氏体结构模糊不清等改变,与神经功能改变的病理学变化特征相一致。2、脊髓缺血再灌注损伤后激活自噬。透射电镜下可见脊髓前角运动神经元胞浆广泛水肿,线粒体肿胀,空泡化,粗面内质网松散、空泡的形成和双层膜包裹细胞器碎片的自噬体;免疫组化下自噬特异性蛋白LC3II的表达明显增加。Western-blot的结果显示:与假手术组相比较,LC3-II/LC3-I的比率表达于再灌注12小时增加显著(P0.05),24小时达到高峰(P0.05),48小时后回落,6h组与48h组LC3-II/LC3-I的比率与假手术组比较,无明显统计学差异(P=0.206 and 0.854,P0.05)。自噬调节蛋白Beclin 1的表达与假手术组相比较,于再灌注6、12、24、48小时四个时间点的表达虽然有增加,但无明显统计学差异(P值分别等于1.000,0.952,1.000及1.000,P0.05)。3、大鼠脊髓缺血再灌注损伤早期,microRNA-204的表达明显上调,其靶蛋白bcl-2的表达下调。与sham组相比较,microRNA-204的表达在6、12、24小时明显上调(P0.05),48小时后回落至假手术组水平(P0.05);靶蛋白bcl-2的表达与sham组相比在6、12、24小时明显下调(P0.05),48小时后回升至假手术组水平(P0.05),二者负相关性。4、鞘内注射antagomiRNA-204慢病毒显著抑制microRNA-204的表达。与control组相比较,在缺血再灌注后的6小时antagomiRNA-204组及antagomiRNA-204+3-MA组的microRNA-204的表达明显减少(P0.05),而vector组及3-MA组的microRNA-204的表达与control组相比较,均无明显统计学差异(allP0.05),说明本实验鞘内注射antagomiRNA-204慢病毒能显著抑制microRNA-204的表达,该作用与3-MA及慢病毒载体无关。5、鞘内注射antagomiRNA-204慢病毒显著改善大鼠后肢的运动神经功能,而鞘内注射3-MA则削弱了这个作用,该作用与病毒载体无关。与control组相比较,vector组MDI评分于再灌注后的6、12、24、48小时4个时间点均无显著差异(P0.05)。与control组相比较,antagomiRNA-204组的MDI评分在4个时间点均显著降低(P0.003),大鼠的后肢运动功能明显增强,而鞘内注射自噬阻断剂3-MA后则削弱了antagomiRNA-204的神经保护作用,即在缺血再灌注损伤后的的4个时间点,antagomiRNA-204+3-MA组大鼠的后肢运动功能明显减弱,与control组相比较,MDI评分没有明显统计学差异(P0.05)。antagomiRNA-204+3-MA组的MDI评分于再灌注12、24小时较antagomiRNA-204组明显增加(p0.05)。6、鞘内注射antagomiRNA-204慢病毒后,健存的神经元细胞数明显增加,凋亡细胞数明显减少。HE染色下antagomiRNA-204组脊髓组织结构比较完整,神经元细胞体呈多角型,胞体结构清晰,胞浆丰富,健存正常运动神经元数明显增加(vs control group,P0.05);而antagomiRNA-204+3-MA组的神经元细胞结构不清,核浓染,空泡增多,细胞间距增加,排列紊乱,健存神经元数目较antagomiRNA-204组显著降低(P0.05),与对照组相比较,无明显差异(vs control group,P0.05)。TUNEL染色下脊髓前角的凋亡神经元细胞计数显示,鞘内注射antagomiRNA-204后,即antagomiRNA-204组的凋亡细胞数较对照组明显减少(P0.05);而给予3-MA干预后的antagomiRNA-204+3-MA组,其脊髓组织中TUNEL染色阳性细胞数目明显增多(vs antagomiRNA-204 group,P0.05),与对照组相比较无明显差异(vs control group,P0.05)。7、鞘内注射antagomiRNA-204慢病毒载体后,大鼠自噬特异性蛋白LC3-II/LC3-I的比率及Beclin 1的表达于再灌注后6小时就显著上调,而3-MA则逆转了这种上调作用。与control组相比较,antagomiRNA-204组的自噬特异性蛋白LC3-II/LC3-I的比率及Beclin 1蛋白的表达显著增加(all P0.05),然而继而鞘内注射自噬阻滞剂3-MA后的antagomiRNA-204+3-MA组与antagomiRNA-204组相比较,LC3-II/LC3-I比率及Beclin 1蛋白的表达明显下降(P0.05)。8、鞘内注射antagomiRNA-204慢病毒载体明显上调抗凋亡蛋白bcl-2蛋白的表达,3-MA对该上调作用无明显影响。与control组相比较,antagomiRNA-204组于缺血再灌注6小时就明显增加其靶蛋白bcl-2的表达,差别有统计学意义,(P0.05);antagomiRNA-204+3-MA组的bcl-2的表达与antagomiRNA-204组相比较无明显统计学差异(P0.05)。9、鞘内注射antagomiRNA-204在脊髓缺血再灌注损伤早期抑制凋亡相关蛋白caspase-3蛋白的表达,该作用与3-MA无明显相关。脊髓缺血再灌注损伤48小时,与sham group相比较,control组及vector组的凋亡相关蛋白caspase-3的表达明显增加(P0.05)。与control group相比较,鞘内注射antagomiRNA-204组的caspase-3的表达明显降低,(P0.05);3-MA组的caspase-3的表达没有显著差异(P0.05)。与antagomiRNA-204组相比较,antagomiRNA-204+3-MA组caspase-3的表达没有统计学差异(P0.05)。结论抑制microRNA-204表达,在大鼠脊髓缺血再灌注损伤早期,对大鼠脊髓神经元有保护作用,其原因主要与促进自噬,抑制凋亡有关。
【图文】：

运动功能,后肢,大鼠,缺血再灌注

图 3.1 各组大鼠后肢运动功能MDI评分(n=10)（sham组：假手术组；6h组：缺血再灌注 6 小时：12h组：缺血再灌注 12 小时：24h组：缺血再灌注 24 小时：48h组：缺血再灌注 48 小时：*vs sham group，P<0.05）3.3 各组大鼠脊髓组织病理学检测结果sham 组(a)脊髓组织结构清晰，可见尼氏体，神经元细胞胞体大小正常，呈多角形，染色均匀，核仁明显。缺血 6h(b）、12h（c）、24h（d）、48h（e）各组神经元细胞结构不清，大小形状各异，正常多极形运动神经元细胞明显减少，细胞肿胀，极性变钝，细胞排列紊乱，细胞间隙变宽，可见出血点，红细胞外逸，，核显示不清，部分细胞变性、坏死，大量空泡形成，核固缩，浓染，见图 3.2。

透射电镜,HE染色,缺血再灌注,前角运动神经元

图 3.2 各组大鼠脊髓HE染色病理组织学变化（图a:假手术组；图b：缺血再灌注 6 小时；图c：缺血再灌注 12 小时；图d：缺血再灌注 24小时；图e：缺血再灌注 48 小时；）3.4 透射电镜及免疫组化检测大鼠脊髓组织自噬特异性蛋白LC3II的表达假手术组(A图）:脊髓组织结构紧致，前角运动神经元胞体结构清楚，大小正常，核质均匀核仁可见，内质网无肿胀，核糖体游离较少，线粒体呈球状或半环状，线粒体内膜向内皱褶形成线粒体嵴（如图C）。缺血再灌注 24 小时组（B 图）脊髓组织结构松散，前角运动神经元胞体膨大，内部结构模糊，胞体水肿，胞质边集，核质染色不均，核仁模糊或裂解，粗面内质网肿胀，游离核糖体增多。细胞中出现许多由单、双层膜组成的囊泡状结构(自
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R614

【参考文献】