负载BFP-1的β-TCP支架复合EPCs构建血管化组织工程骨修复兔股骨干节段性骨缺损的研究

发布时间：2020-05-19 21:46

【摘要】：目的:1、探讨骨形成肽-1(BFP-1)对兔外周血内皮祖细胞(EPCs)增殖、迁移和成血管功能的影响及可能的分子机制。2、研究β-磷酸三钙支架(β-TCP)负载BFP-1的体外释放规律,观察EPCs在负载BFP-1的β-TCP支架上的活性和增殖情况。3、探讨负载BFP-1的β-TCP支架复合自体EPCs构建的血管化组织工程骨β-TCP/BFP-1/EPCs用于修复兔股骨干节段性骨缺损的血管生成和骨生成的效果。方法:1、应用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、培养兔外周血EPCs,并对EPCs进行表型和功能的鉴定。选用第三代EPCs,用不同浓度的BFP-1(100,200,300μg/ml)干预EPCs 1至7天,使用CCK8比较细胞的增殖情况;应用Transwell检测不同浓度的BFP-1对EPCs迁移能力的影响;检测不同浓度的BFP-1对EPCs在Matrigel上形成血管样结构的影响。2、使用不同浓度的BFP-1处理EPCs 1天和3天后,采用荧光定量PCR检测成血管相关基因VEGF、VEGFR2、e NOS和ALK-1的表达;通过western blot检测不同浓度的BFP-1作用于EPCs 1天后Smad 1/5蛋白的表达。3、采用冷冻干燥法将BFP-1负载至β-TCP支架上制作β-TCP/BFP-1支架复合体,应用酶标仪检测BFP-1自β-TCP支架上的释放性能;将EPCs接种于β-TCP/BFP-1支架复合体上,体外培养1至10天,使用共聚焦显微镜观察EPCs在支架复合体上的活性和增殖情况。4、采用负载BFP-1的β-TCP支架与自体外周血EPCs复合构建血管化的组织工程骨(β-TCP/BFP-1/EPCs),并构建组织工程骨β-TCP/EPCs、β-TCP/BFP-1和β-TCP,比较研究其对新西兰大白兔股骨干节段性骨缺损的修复效果。5、术后4周和12周对各组动物进行Microfil血管造影、Micro-CT血管扫描和组织学免疫组化染色,评估组织工程骨内的血管生成情况。6、术后4周和12周对各组兔子进行X线片、Micro-CT骨扫描和组织学切片检查,评估组织工程骨内的骨生成情况,并于术后12周时进行三点弯曲试验评估骨修复的力学效果。结果:1、兔外周分离出的EPCs能够形成“铺路石”样排列,细胞表面分子标记VEGFR2和v WF荧光染色阳性,EPCs可摄取Dil-Ac-LDL且能与FITC-UEA-1结合。2、不同浓度的BFP-1均对EPCs的增殖无不良影响。BFP-1可促进EPCs的迁移和形成血管样结构,上调EPCs基因VEGF、VEGFR2、e NOS和Alk-1的表达,并使其Smad1/5蛋白磷酸化的水平升高,以200μg/ml的浓度效应最为显著。3、β-TCP支架能够吸附BFP-1,其结合的BFP-1在经历短期的突释后能够缓慢稳定释放长达28天。β-TCP支架具有较好的细胞相容性,EPCs可以在β-TCP支架上正常的生长和增殖。EPCs在构建的β-TCP/BFP-1复合体上可以正常生长,细胞能够保持较高的增殖活性。4、Micro-CT血管扫描显示构建的β-TCP/BFP-1/EPCs组织工程骨在术后4周和12周的血管体积分数和血管面积值均显著高于β-TCP/EPCs组、β-TCP/BFP-1组和β-TCP组。CD34免疫组化分析显示β-TCP/BFP-1/EPCs组在术后4周和12周的新生血管密度均较β-TCP/EPCs组、β-TCP/BFP-1组和β-TCP组的高。5、术后12周的X线片评分和Micro-CT骨扫描分析结果显示构建的β-TCP/BFP-1/EPCs组的新生骨量明显高于β-TCP/EPCs组、β-TCP/BFP-1组和β-TCP组。HE染色示在植入4周和12周后β-TCP/BFP-1/EPCs组的骨移植物与断端自体骨交界区的整合最为致密。4周和12周时硬组织切片Van-Gieson染色见β-TCP/BFP-1/EPCs组的新骨生成面积显著高于β-TCP组、β-TCP/BFP-1组和β-TCP/EPCs组,同时β-TCP/BFP-1/EPCs组支架的降解量明显多于β-TCP/EPCs组、β-TCP/BFP-1组和β-TCP组。生物力学结果示β-TCP/BFP-1/EPCs组的最大载荷和最大弯曲应力显著高于与β-TCP/BFP-1组、β-TCP/EPCs组和β-TCP组。结论:1、应用密度梯度离心法和贴壁培养法可获得高纯度、足量的内皮祖细胞。2、BFP-1具有促EPCs成血管的作用,且BFP-1通过ALK-1/Smad信号通路介导其促EPCs成血管的效能。3、β-TCP支架能够相对缓释BFP-1,负载BFP-1的β-TCP支架具有较好的细胞相容性并能支持EPCs的增殖。4、构建的β-TCP/BFP-1/EPCs血管化组织工程骨具有较好的组织相容性,在体内有较强的促血管生成效应,同时有较好的成骨效能,修复负重区大段骨缺损的效果可靠,这种复合构建血管化组织工程骨的方式简单、有效,具有较好的临床应用前景。
【图文】：

细胞呈向梭形转变（图1-1A）。接种至第 5 天，细胞出现加速生长，，梭形细胞呈放射状排布（图 1-1B）。之后，细胞增殖进一步加快，第 10 天时细胞形态渐趋均一，局部出现“铺路石”样排列（图 1-1C）。图 1-1，EPCs 在光镜下的形态观察Figure 1-1, Morphology of EPCs observed under microscope. The cells showedtypical cobblestone-like appearance after 10 days. Scale bar = 100 μm

19表面标记 VEGFR2 的荧光鉴定unophenotype of EPCs showed the expression ofr fluorescent microscope. Scale bar = 100 μm.
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.8

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本文编号：2671535