Nell-1对出生后小鼠软骨内稳态及软骨内成骨的影响与机制研究

发布时间：2020-05-21 12:36

【摘要】：作为一种在骨-软骨组织内广泛分布的分泌蛋白,Nell-1最早因在颅缝早闭患者的颅骨组织内异常高表达而被发现。通过大量研究,其对颅面部骨骼系统生长发育的调控作用和对缺损颅骨的修复作用均已得到证实。目前用于研究Nell-1功能缺陷的小鼠模型源于N-乙基-N-亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)诱导所致的Nell-1基因点突变。然而,纯合突变小鼠因全身多处骨-软骨组织的发育异常而在出生后无法存活,从而使后续的观察和研究无法进行。因此,本研究运用Cre-Lox P重组系统,使表达Col2α1-Cre的软骨细胞表现出明显的Nell-1缺陷,成功建立条件性Nell-1软骨特异性敲除小鼠模型(Nell-1Col2α1KO),并在新生阶段(出生后0天),青春生长发育阶段(出生后1个月)以及成年阶段(出生后3个月)对其进行观察。结果表明,WT组与Col2α1-Cre阴性对照组无统计学差异,条件性Nell-1软骨特异性敲除对雄性小鼠及雌性小鼠产生的影响趋势相同,具体如下:新生WT及Nell-1Col2α1KO小鼠的外观无明显差异,Alcian Blue-Alizarin Red骨骼染色及体外micro-CT扫描结果显示,Nell-1Col2α1KO新生小鼠无骨或软骨的缺损或缺失,但其股骨长度略小于WT对照组。随着生长发育的持续进行,WT与Nell-1Col2α1KO小鼠之间的差异越发明显。在出生后1个月及3个月时,Nell-1Col2α1KO小鼠表现出了明显短小的身材,其身长、尾长及体重均显著降低。与此同时,Nell-1的软骨特异性敲除也导致小鼠在出生后1个月时就表现出了明显的骨质疏松症状并稳定延续至成年,具体表现为股骨及胫骨的长度,骨矿化密度,骨容积,骨小梁数量,骨小梁厚度,骨小梁间距,皮质骨体积,皮质骨厚度及皮质骨矿化密度的异常。此外,生长板下方松质骨表面成骨细胞及破骨细胞的数量及功能也因Nell-1的缺陷而受到影响。通过骨组织形态计量分析,我们发现Nell-1的软骨特异性敲除使出生后1个月及3个月小鼠股骨及胫骨生长板下方松质骨的矿化沉积率及骨表面新骨形成率都显著降低,从而明确了Nell-1对松质骨形成的重要性。松质骨的形成基于软骨内成骨。通过活体micro-CT连续4周的动态观察,我们发现Nell-1Col2α1KO小鼠股骨及胫骨次级骨化中心处的矿化受到了明显的抑制。与WT对照组相比,Nell-1Col2α1KO小鼠次级骨化中心处的矿化不仅出现的时间点滞后,形成的骨体积也更小,进一步表明Nell-1参与对软骨内成骨过程的调控。接下来,我们从组织学层面对WT及Nell-1Col2α1KO小鼠的生长板软骨进行观察。实验结果表明,条件性Nell-1软骨特异性敲除降低了出生后期小鼠生长板内软骨细胞的增殖水平,并影响其分化及成熟的过程。具体表现为Nell-1Col2α1KO小鼠生长板软骨组织内降低的Safranin O,Col-2以及Col-10染色;同时,Brd U阳性细胞数减少,出生1个月时增殖软骨细胞层厚度降低。这些体内所观察到的变化均可在体外实验中通过对原代WT及Nell-1Col2α1KO软骨细胞进行分离培养而得到验证:MTT检测证实了Nell-1Col2α1KO软骨细胞增殖水平的下降,而Col-2及Aggrecan基因表达的减少和Alcian Blue染色的减弱都证明了Nell-1Col2α1KO软骨细胞分化程度的异常。值得注意的是,这些在体外实验中因Nell-1缺陷而表现出的不足都可通过对Nell-1Col2α1KO软骨细胞施以人重组Nell-1蛋白(rh NELL-1)而实现一定程度的补救,从而直接阐明了Nell-1对软骨细胞增殖、分化、成熟的重要影响,以及在维持生长板软骨内稳态过程中的必要性。为了探究Nell-1在出生后期影响小鼠软骨内稳态并进而影响软骨内成骨过程的机制,我们对Nell-1以及在这一过程中发挥重要作用的Ihh-PTHr P信号通路之间的关系进行探究。实验结果表明,条件性Nell-1软骨特异性敲除严重影响了Ihh及其受体Patched-1,PTHr P及其受体PTHr P-R的表达。在Nell-1Col2α1KO小鼠的生长板内,通过免疫组织化学染色,我们可以看到,Ihh、Patched-1、PTHr P以及PTHr P-R的表达区域更为局限,表达水平也明显降低。与之相应的是,在体外实验中,相比于WT对照组,Nell-1Col2α1KO软骨细胞所呈现出的Ihh-PTHr P信号通路中的主要因子,即Ihh、Patched-1、Smo、Gli-1以及PTHr P基因表达水平的显著下降,同时伴有Col-2及Aggrecan基因的低表达;此外,Western Blotting结果也表明在Nell-1Col2α1KO软骨细胞中,Ihh、Patched-1、PTHr P以及PTHr P-R的蛋白表达水平也明显降低。这些随Nell-1敲除而产生的基因水平及蛋白水平的表达降低均可因rh NELL-1的加入而出现回升;但在对软骨细胞加入Ihh信号通路的抑制剂环杷明后,rh NELL-1的效果便无法得到发挥。这表明,Nell-1可通过上调Ihh-PTHr P信号通路而实现对软骨细胞的调控。更进一步,我们对Nell-1和Gli-1的关系进行了探究。作为Ihh信号通路中重要的转录因子,在正常情况下,Gli-1在信号通路被激活时,将入核并启动下游基因的表达。通过研究我们发现,随着Nell-1的软骨特异性敲除,Nell-1Col2α1KO软骨细胞核内Gli-1的蛋白表达水平发生了下调;而随着rh NELL-1的加入,细胞核内Gli-1的蛋白表达水平又出现上升。这一结果可通过免疫细胞染色进行观察,并通过Western Blotting进行验证。同时,在Nell-1Col2α1KO软骨细胞中,我们还观察到,Gli-1的下游目的基因Hip-1和N-Myc的表达水平也出现了显著下降,虽然加入rh NELL-1可以上调其表达,但Gli-1的抑制剂GANT61的应用使rh NELL-1无法对Hip-1和N-Myc的基因表达水平产生影响。通过本研究我们可以看到,条件性Nell-1软骨特异性敲除将使小鼠出现明显的肢体短小,并伴有早期发生的明显的骨质疏松症状。而基于各项实验结果,我们可以证明,在小鼠出生后,Nell-1可上调Ihh-PTHr P通路中重要信号分子的表达,增强软骨细胞内Gli-1在细胞核内的表达及功能,促进软骨细胞的增殖和分化,从而实现对生长板软骨内稳态的维系;并进一步通过促进软骨细胞的成熟,调控成骨细胞及破骨细胞的数量和功能,影响软骨内成骨过程中发生在次级骨化中心处的矿化以及生长板下方松质骨的形成。因此,Nell-1对出生后小鼠的软骨内稳态及软骨内成骨具有重要的调控作用。
【图文】：

小鼠,软骨组织,深蓝色,多处

图 2.1 Col2α1-Cre 在软骨组织内的成功表达（A）whole-mount X-gal 染色：无 Col2α1-Cre表达的 WT 小鼠未见阳性染色，而有 Col2α1-Cre 表达的 Nell-1Col2α1-R26RKO 小鼠可见全身多处深蓝色 X-gal 阳性染色。其中，股骨及胫骨的 X-gal 染色仅出现在软骨端，骨干未见染色；（B）Col2α1-Cre 的特异性持续表达：出生 0 天，1 个月及 3 个月的胫骨生长板内均可见特异性的 X-gal 阳性染色。

软骨组织,特异性,小鼠,生长板

图 2.1 Col2α1-Cre 在软骨组织内的成功表达（A）whole-mount X-gal 染色：无 Col2α1-Cre表达的 WT 小鼠未见阳性染色，而有 Col2α1-Cre 表达的 Nell-1Col2α1-R26RKO 小鼠可见全身多处深蓝色 X-gal 阳性染色。其中，，股骨及胫骨的 X-gal 染色仅出现在软骨端，骨干未见染色；（B）Col2α1-Cre 的特异性持续表达：出生 0 天，1 个月及 3 个月的胫骨生长板内均可见特异性的 X-gal 阳性染色。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R68

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