程序性坏死在氧化应激诱导髓核细胞死亡中的作用及机制研究

发布时间：2020-05-24 06:28

【摘要】：第一部分程序性坏死参与氧化应激诱导髓核细胞死亡的研究目的:研究氧化应激条件下的髓核细胞是否发生程序性坏死,并探讨其可能机制。方法:选取第2代大鼠胸腰段椎间盘髓核细胞,分别用不同浓度H_2O_2处理不同时间,采用cell counting kit-8(CCK-8)评估细胞活性,选择适宜的浓度和时间用于后续实验。通过倒置相差光学显微镜观察细胞形态学变化,Annexin V/propidium dide(PI)染色和Hoechst 33258/PI染色分别检测PI阳性率,透射电镜观察细胞超微结构变化,RT-PCR及Western Blot检测RIP1、RIP3的基因及蛋白表达变化。此外,使用Nec-1、基因沉默进一步评估坏死性凋亡对细胞活性及死亡率的影响,免疫组化检测正常及退变椎间盘中RIP1,RIP3蛋白表达差异。结果:H_2O_2呈剂量和时间依懒性降低髓核细胞活性。随着H_2O_2浓度升高,呈现死亡形态的细胞明显增多,PI阳性率逐渐升高,细胞超微结构呈现坏死样改变。RIP1和RIP3基因及蛋白表达均明显增高。而Nec-1预处理能够明显抑制H_2O_2诱导的细胞活性下降、死亡增多、PI阳性率升高及坏死样超微结构改变。转染SiRNA-RIP3能够降低H_2O_2诱导的细胞死亡,而SiRNA-RIP1效果则相反。人体标本免疫组化结果证实,与正常髓核组织相比,退变髓核内RIP1、RIP3蛋白表达水平明显较高。结论:RIP1/RIP3介导的程序性坏死参与H_2O_2诱导的髓核细胞死亡,而RIP1的作用可能具有两面性,适度表达则可能促进细胞存活,过度表达促进程序性坏死发生。调控程序性坏死有望为降低氧化应激诱导的髓核细胞死亡,进而为椎间盘退行性变的防治提供全新的策略。第二部分氧化应激诱导髓核细胞发生程序性坏死的机制研究目的:探讨RIP1/RIP3介导的髓核细胞程序性坏死与PARP-AIF信号通路相互关系。方法:选取第2代大鼠胸腰段椎间盘髓核细胞,在H_2O_2(250μM)处理24 h后,荧光探针JC-1染色后流式及激光共聚焦检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)变化情况,荧光探针H2DCF-DA染色后流式及激光共聚焦检测细胞活性氧(ROS)水平改变。Western Blot检测PARP、PAR、线粒体和细胞核AIF蛋白表达情况,酶标仪检测PARP酶活性变化,AIF免疫荧光染色后激光共聚焦观察AIF转位,CCK-8检测细胞活性,PI染色检测细胞死亡率。此外,利用RIP1特异性抑制剂Nec-1,PARP特异性抑制剂DPQ,以及基因沉默进一步评估程序性坏死对细胞活性及死亡率的影响。结果:H_2O_2作用24h后,氧化应激指标ROS明显升高,线粒体膜电位明显下降,提示H_2O_2条件下氧化应激水平升高,线粒体功能严重受损。而Nec-1明显抑制H_2O_2诱导的ROS升高,线粒体膜电位下降,表明Nec-1能够降低H_2O_2诱导的氧化应激水平升高,减轻线粒体功能紊乱。随着H_2O_2浓度增加,PARP蛋白表达逐渐下降,裂解的PARP(C leaved-PARP)蛋白表达逐渐升高,PARP酶活性及PAR蛋白表达水平明显升高,线粒体AIF蛋白表达水平逐渐下降,细胞核AIF蛋白表达水平逐渐升高。而Nec-1、SiRNA-RIP3能明显抑制PARP活性及蛋白表达变化,SiRNA-RIP1则相反。DPQ明显抑制线粒体AIF下降和细胞核AIF升高,SiRNA-AIF能够明显减轻细胞死亡,提高细胞活性。结论:PARP-AIF途径作为RIP1/RIP3的下游途径,在H_2O_2诱导髓核细胞程序性坏死过程中可能发挥关键性作用。调控氧化应激条件下髓核细胞RIP1/RIP3-PARP-AIF信号通路有望为降低氧化应激诱导的髓核细胞死亡,进而为延缓甚至逆转IVDD提供新的策略与思路。
【图文】：

活性下降,保护作用,细胞死亡

33图 1. Nec-1 对 H2O2导致髓核细胞活性下降的保护作用。（A）：髓核细胞经过不同浓度（a, 0 μM; b, 125 μM; c, 250 μM; d, 500 μM）的H2O2处理24 h，显示出细胞死亡随H2O2浓度依赖性增加。（B）：在不同浓度（a, 0 μM; b, 125 μM; c, 250 μM; d, 500 μM）H2O2处理24 h之前，，用Nec-1预处理NP细胞，显示出细胞死亡明显减少。（比例尺=50 μm）。（C，D）：使用 CCK-8 法测量经 H2O2处理的髓核细胞的活力。在有或无 Nec-1 预处理的情况下，将髓核细胞置于不同浓度的 H2O2中处理 24 h（C）；将 NP 细胞置于 250μM 的 H2O2不同的时间段（D）：以上数据均来自 3 次独立重复实验的均值±标准差（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs. control）。

细胞死亡,阳性率,定量统计分析,流式

34 2. Nec-1 对 H2O2诱导的NP 细胞死亡的影响。（A）：Annexin-V / PI 双重染色后流胞仪分析细胞死亡率。（B）：流式检测 PI 阳性率的定量统计分析。PI 阳性率呈浓赖性升高，Nec-1 可有效抑制其升高。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.55

【参考文献】