可溶型CD74通过NF-κB信号通路调控肺炎症反应的实验研究

发布时间：2020-05-26 02:09

【摘要】：研究背景急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由肺内或肺外因素引起的,以顽固性低氧血症为显著特征的临床综合征。ARDS在烧伤创伤等重症ICU患者中发生率高,死亡率高,救治难度大,是临床面临的普遍难题,也是临床和基础研究的热点话题。基础研究发现,ARDS发病机制是全身失衡的炎症反应介导的肺实质性损伤,其中炎症因子尤其是炎症因子的级联放大效应发挥了重要作用。ARDS发生过程中产生的炎症因子,部分可成为独立损伤因素,参与ARDS的发生发展。CD74是细胞膜上一种由232个氨基酸组成的单次跨膜受体蛋白,膜上CD74能够和巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)相互结合参与ARDS的发生发展。膜上CD74蛋白分为三段结构,其中1-46位氨基酸位于细胞膜内,47-72位氨基酸是跨膜序列,73-232位氨基酸位于细胞膜外被称为膜外段。可溶型CD74分子(soluble CD74,sCD74)是CD74分子的细胞膜外段。2014年耶鲁大学的Richard Bucala教授团队在自身免疫性肝病中首次报道了sCD74的存在,初步证实了sCD74在免疫疾病中的重要作用。Kim团队也发现了非存活的烧伤患者的血清中,sCD74在烧伤后12h时含量较低,但24h后开始逐渐升高。我们实验团队前期对sCD74做了部分研究,发现在ARDS小鼠模型中,小鼠外周血清和肺泡灌洗液中均存在sCD74,并且sCD74的含量和ARDS的严重程度成正相关。此外,小鼠肺泡灌洗液中sCD74含量和炎症因子TNF-α、IL-6含量呈正向回归关系。在临床研究中发现,ARDS患者早期血清中sCD74水平显著升高,并且升高的sCD74和ARDS患者不良预后密切相关。这些结果均提示sCD74可能参与ARDS发生和进展过程。那么其在ARDS过程中究竟扮演什么样的角色?是否和其他炎症因子一样作为独立损伤因素加重肺损伤?目前还没有相关文献报道。因此本课题分别在体内和体外证实了sCD74能促进小鼠肺组织和肺相关细胞的炎症反应,并初步探讨了其可能的机制,证实sCD74是通过激活炎症经典信号通路NF-κB来促进炎症反应的。第一部分:sCD74气道滴入诱发小鼠炎症反应(体内实验)研究目的:在动物水平探究sCD74是否促进小鼠肺组织发生炎症反应研究方法:通过气道滴入方式探究sCD74对小鼠肺组织的影响,根据sCD74刺激作用时间的不同分为2h、6h、8h、12h、24h组,根据sCD74刺激剂量不同分为0.01、0.1、0.5、1、2mg/kg等浓度梯度,同时加入Ig-Fc蛋白作为实验对照,在指定时间内收取小鼠外周血清、肺组织、肺泡灌洗液等标本。采用RT-PCR法检测肺组织炎症基因相对表达量;通过ELISA法检测肺泡灌洗液中炎症因子的含量;通过BCA蛋白定量法检测肺泡灌洗液中总蛋白含量;通过肺干湿比探究肺水肿程度;通过HE染色了解肺大体损伤情况;通过ELISA法检测外周血清中炎症因子含量。研究结果:肺组织炎症基因TNF-α、MIP-2和IL-6在0.5mg/kg sCD74气道滴入2h后分别增高2.1、3.4和2.8倍,之后炎症基因逐渐降至正常对照水平。肺泡灌洗液中炎症因子TNF-α、MIP-2含量随时间变化先增高后下降,8h是炎症因子分泌的高峰点,分别为560pg/ml和107 pg/ml。在浓度效应上,炎症基因相对表达量和炎症因子含量和气道滴入浓度存在依赖关系。sCD74和Ig-Fc蛋白相比在促进炎症基因的高表达和炎症因子的分泌方面都有统计学差异。气道滴入sCD74后小鼠肺泡灌洗液中总蛋白含量、肺组织干湿比和外周血清炎症因子和对照组相比均无统计学差异,肺HE染色显示无明显损伤。研究结论:气道滴入sCD74能够引起小鼠肺局部的炎症基因高表达和相应的炎症因子的分泌,但对于肺整体的炎性损伤作用和全身炎症反应影响较小。第二部分:sCD74诱导肺相关细胞发生炎症反应(体外实验)研究目的:在细胞水平探究sCD74是否促进肺相关细胞产生炎症反应研究方法:分别选用RAW264.7作为肺巨噬细胞代表,A549作为肺上皮细胞代表,HUVEC作为肺血管内皮细胞代表,在三种细胞系中探究sCD74的生物学作用。根据sCD74和细胞共孵育时间不同分为2h、8h、12h、24h组,根据和细胞共孵育sCD74浓度的不同分为10、100、1000ng/ml组,在相应的时间内收集细胞和细胞上清。采用RT-PCR法分析细胞中炎症基因的相对表达量,采用ELISA法检测细胞上清中炎症因子的分泌情况。研究结果:1000ng/ml sCD74刺激巨噬细胞,在2h时炎症基因TNF-a、MIP-2和IL-6相对表达量增高最明显,分别增高4.0、11.8、2.6倍,之后炎症基因逐渐降至正常对照水平。巨噬细胞上清液中炎症因子TNF-a和MIP-2含量随着刺激时间的延长和刺激浓度的增高而增加。sCD74能够在8h时刺激A549和HUVEC细胞炎症基因TNF-a和IL-6高表达,但对炎症因子的分泌无影响。研究结论:sCD74能够促进肺相关细胞炎症基因表达增加,同时也能刺激巨噬细胞分泌炎症因子增多。第三部分:sCD74调控肺炎症反应机制的探究研究目的:1.探究sCD74促进炎症反应的信号通路。2.sCD74细胞膜受体的初步探究。研究方法:1000ng/ml sCD74刺激巨噬细胞0、10、30min后分别提取胞质和胞核蛋白,采用Western Blotting检测胞质中IκB、phosphate-IκB、P65、phosphate-P65和胞核中phosphate-P65蛋白表达情况。采用BAY11-7082预处理巨噬细胞30min后,再重复上述实验,检测检测上述信号通路蛋白表达的变化。采用BAY11-7082预处理巨噬细胞30min后,1000ng/ml sCD74刺激巨噬细胞24h,用ELISA法检测细胞上清中炎症因子分泌的变化。在A549、HUVEC、HEK293、Jurkat、RBL和RAW264.7等细胞系中,采用流式细胞技术分析hsCD74和它们细胞膜的结合情况。研究结果:sCD74刺激巨噬细胞后,细胞质中phosphate-IκB、phosphate-P65和细胞核中phosphate-P65蛋白含量明显增多。NF-κB通路抑制剂处理后上述增高的通路蛋白又明显降低。BAY11-7082预处理巨噬细胞能够有效抑制sCD74分泌炎症因子。hsCD74能够以剂量依赖的方式和多种人源性细胞(A549、HUVEC、HEK293、Jurkat)膜结合,hsCD74不能和大鼠源性(RBL)和小鼠源性(RAW264.7)细胞膜结合。研究结论:sCD74能通过激活NF-κB通路促进肺炎症反应的发生。hsCD74能够和多种人源性细胞细胞膜结合。
【图文】：

小鼠,气道,基因

海军军医大学硕士学位论文实验结果一、sCD74 气道滴入后小鼠肺组织中炎症基因的表达情况为了明确 sCD74 是否会导致机体炎症反应，气道滴入的方式给予 sCD74（0.5mg/kg 体重）处理小鼠不同时间（0，2，6，8，12，24h），采用 RT-PCR 的方法检测小鼠肺组织中炎症基因 mRNA 的表达情况。结果如图 1 所示，与对照组相比，sCD74 滴入小鼠 2h，小鼠肺组织中炎症基因 TNF-α（图 1A）表达增加至对照的 2.1 倍（P＜0. 001），该作用延续至 8 小时，12 小时开始降低，24 小时基本恢复到对照水平（P＞0.05）。同样，，sCD74 也能促进小鼠肺组织炎症基因 MIP-2(图 1B)和 IL-6(图 1C)高表达，在 2h 时效果最明显，分别增高至对照组的 3.4 倍（P＜0. 001）和 2.8 倍（P＜0. 001）。上述实验结果提示，sCD74 气道滴入早期（2h 至 8h）能够增加小鼠肺组织中炎症基因的表达。

气道,小鼠,基因,融合蛋白

图 2：不同浓度 sCD74 气道滴入小鼠肺组织炎症基因 TNF-（aA）、MIP-2(B)和 IL-6(C)的相对表达量。（n=3/组，nsP＞0.05，*P＜0.05，***P＜0.001 VS ctrl）sCD74 重组的过程中加入了起稳定作用的鼠源性 Ig-Fc 片段，构建成融合蛋白。虽然相关报道表明融合蛋白对目标蛋白本身生物学功能无影响，是蛋白重组的重要实验手段。但为了排除融合蛋白中 Ig-Fc 片段对实验结果的影响，我们进一步检测了 Ig-Fc 蛋白是否影响上述炎症基因的表达。结果如图 3 所示，0.5mg/kg Ig-Fc 蛋白气道滴入小鼠 2h 与对照相比，上述炎症基因均无明显改变（P＞0.05）。上述结果表明，Ig-Fc 蛋白不能促进小鼠肺组织中炎症基因表达增加，是 sCD74 促进小鼠肺组织炎症基因表达增加。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R644;R563.8

【参考文献】